В.И. Иванов - Генетика, страница 99

М итохондриальные болсзни Органические ациду- рии Болсзни пуриновага и пнримидиновага обмена Болезни углеволного обмена Лизосомные болезни Болезни нарушения митохондрнального б-окисления 1>алсзни обмена метал- лом 1 1а следственные болез- ~ ~н мстабалитнага трап нарзз Наследственные болез- нии желудочна-кишеч- ного тракта Болезни халестерино- вого обмена Болезни нсйротранс- миттсрного обмена Болезни обмена гема и порфнрннов Наследственные эндо- кринопатии Олигасахаридьг Каринтии и его эфиры, разветвленныеинеразветвленные дикарбановые кислоты от Сб до С14 ОДЦЖК, фитановая кислота, желчные кислоты, плазмалогены, пипекалиновая кислота Ионы металлов, сульфатов, аминокислот Сиаловые кислоты, хлариды, сахара 407 Гдопп гй Наследгпнгггооппи и паппногин о ом<ч ) )ниболее точным, но сложным н обл1шояяним малой пропускной способностью (2 анализа в сутки) методом шгляе'шя но~ нх1бмснная жидкостная хромато~рафия с иснольюванием аминокислотного анализатора.

Метод высоковольтного электрофореза с последующей нисходящей хромато|рафией аминокислот на бумаге дает ту же информацию, но отличается высокой пропускной способностью (30 — 40 проб в сутки), дешевле, чем ТСХ, но менее чувствителен. В последние годы все большее значение приобретают высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и хроматомасс-спектрометрия (ХМ С).

ХМС вЂ” комбинированный метод хроматографии и масс-спектрометрии. Он позволяет получать как количественную, так и качественную информацию, например, определять какие вещества, с какой молекулярной массой, присутствуют в анализируемой пробе и в каком количестве. Кроме того, с помощью ХМ С можно получить количественную информацию о неразделенных или совместно элюнруемых соединениях, что является одним из важных преимуществ этого метода.

Тандем ная масс-спектрометрия (ТМ С) — метод, с помощью которого можно количественно оценить 3000 метаболических маркеров разных групп НБО одновременно и охарактериювать классы веществ и их молекулярную массу. При этом времени для подготовки проб и проведения анализа затрачивается существенно меньше, чем при использовании некоторых выше перечисленных методов, например, при ГХ. Таким образом, совершенствование методов биохимической диагностики позволяет выявлять и подтверждать все большее количество нарушений обмена веществ.

Классы НБО, диагностируемые с применением различных биохимических методов анализа, представлены в табл. 19.5. 19.4.3, МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХЗАБОЛЕВАНИЙ ЧЕЛОВЕКА Наиболее адекватные методы, обеспечивающие точную диагностикумоногенных заболеваний, основаны на исследовании ДНК в районе определенных генов. Несмотря на то, что молекулярно-генетические методы, как правило, весьма сложны, трудоемки и дорогостоящи, данные, полученные в процессе ДНК-диагностики намного точнее и информативнее данных других анализов.

Известно, что ДН К остается неизменной на протяжении всей жизни организма и одинакова во всех ядерных клетках, что позволяет использовать для анализа практически любые клетки оршнизма, полученные на разных стадиях онтогенеза. Кроме того, с помощью ДН К-анализа поврежденный ген можно обнаружить не только при наличии развернутой клинической картины заболевания, но и до появления симптомов, а также у здоровых гетерозиготных носителей мутации в гене. Предметом ДНК-диагносгики может быть как исследование гена с целью выявления мутаций (прямой подход ДНК-диагностики), так и анализ сегрегации заболе|и- Часмв П Медицинских еенемика 466 ' ния в определенной семье с полиморфными уч;юткпми Д1! К (мпрксрными покусами), тесно сцепленными с поврежденным )сном (кигнеииыи ииг)лог) 1(ИК-г)игл носишки).

Прямая и косвенная ДНК-диагносгика основана на методах, нозвшиюгцих идентифицировать небольшой, но строго определенный фрагмент ДНК человека. Обычно для этого используют блот-гибридизацию либо ам ~ )лиф икаци ю с последующим анализом полученных образцов ДНК при помощи электрофореза в агарозном или полиакриламидном гелях или радиоавтографии (гл. 18).

Прямые методы ДНК-днагностнкн использукпся в тех случаях, когда известен ген, ответственный за возникновение наследственного заболевания и основные типы его патологических мутаций. Использование прямых методов ДНК-диагностики целесообразно для таких заболеваний как муковисцидоз (мажорная мутация г(е1Г508), фенилкетонурия (Р408%), хорея Гентинггона (экспансия СТО-повторов) и ряда других. Главное преимущество прямого метода — это высокая, практически 100% точность диагностики и отсутствие необходимости ДНКсанализа всех членов ядерной семьи.

Обнаружение мутации в соответствующем гене позволяет абсолютно точно подтвердитьдиагноз наследственного заболевания и определить генотип всех членов отягощенной семьи. Еще одно достоинство прямой диагностики — возможность выюшения гетерозиготного носительства патологических мутаций у родителей умершего больного и его родственников, что особенно актуально для аугосомно-рецессивных заболеваний.

Основной недостаток прямых методов состоит в том, что для их применения требуется знание точной локализации патологического гена в геноме, его экзон-интронной структуры и спектра его мутаций. Такая информация на сегодняшний день доступна далеко не для всех моногенных болезней человека. К недостаткам прямых методов следует также отнести их неполную информативность, что связано с наличием широкого спектра патологических мутаций в одном и том же гене, обусловливающих развитие наследственного заболевания. В зависимости от объема спектра мутаций в определенном гене, эта информативность может широко варьировать.

Часть семей в этом случае остается неинформативной для ди- Таблица 19.6. Информативность прямых методов ДНК-днагноетнкн для различных заболеваний 4ВЧ Пынн /Ч Пснндг)гп~ннллоглл и нгпнгмнннн надин нн агностики. 3абл. (96 даст прелставленис об и>~формативности прямых мсгодовдля разли п>ых я>болеваний. Кпсвеияыс методы ДНК-диагностики применяют в том случае, если ген, повреждение и котором приводит к заболевщ >ик>, ~ ю идентифицирован, а лишь локализован на определенной хромосоме, или когда методы прямой ДНК-диагностики не >щк>т результата, (например, при значительной протяженности и сложной молекуляр>юй организации гена, а также широком спектре патологических мутаций в нем).

Косвенные методы ДНК-диагностики основаны на анализе сегрегации в семье аллслей полиморфных маркеров, находящихся в том же хромосомном регионе или зесно сцепленных слокусом заболевания. Полиморфные маркеры, используемые для косвенной ДНК-диагностики, представляют собой точковые замены, делецииуинсерции, повторы, полиморфизм которых обусловлен различным количеством элемс»- тов в блоке.

Наиболее удобными для косвенной ДН К-диагностики признаны микросателлитные (мономер до 5 и н ) и минисателлитные (мономер повюра состоит из 5 — 60 п.и.) пол иморфн ые маркеры, широко распространенные в ге номе человека. Для абсол ютного большинства известных в настоящее время полиморфных сайтов такого типа был строго показан менделевский характер наследования. Наиболее типичными среди микросателлитов являются динуклеотидные повторы, а самым распространенным из них — «СА»-повтор. Показано, что кластеры «СА«-по>ггоров встречакпся в геноме в среднем каждые 30 тысяч нуклеотидных пар. Во многих кластерах присутствует от 10 до 30 динуклеотидных повторов и типичное количество аллелей составляет 4 — В, что обеспечивает высокую информативность маркера. Для количественной оценки информативности данного маркера введена вел ичина, получившая название информационного содержания полиморфизма (Р!С вЂ” аг англ.

рейн>огр)>(гн> т~огтаг>ол со>пе>п), которая вычисляется по следующей формуле; Р>С = ) — ~Р> — ььР~Рь где Р, — частота >-го аллеля Эта величина определяет вероятность того, что изучение генотипа ребенка из исследуемой семьи и его родителей с помощью полиморфного маркера позволит определить: с каким из аллелей в данной семье сцеплено повреждение. Ценность поли морф ного маркера для ДНК диагностики зависит не только от оп> информативности, но и генетического расстояния между маркером и повреждением в гене, так как точность оценки генетического риска в значительной степени определяется часютой рекомбинации между сайтом повреждения и полиморфны м локусом.

Применение косвенных методов молекулярной диагностики предусматрив;>ег также в качестве обязательного предварительного этапа исследование частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анализируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носителей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и неравновесия по сцеплению между маркерным и сайтами и муга> гп ~ ими аллелями гена. Таким образом, основной недостаток косвенных методов заключается в их нс !00%-ной точности.

Действительно, возможная ошибка обусловлена вероятными 41() Чаент П. Медининекан генетика рекомбинациями между изучаемым полиморфным локусом и повреждением в гене, а величина этой ошибки определяется двумя факторами: ге~ ~етическим расстоянием между полиморфным локусом и мутацией, приводящей к заболеванию, и генетическим размером самого гена. Очевидно, что для уменьшения ошибки необходимо использовать маркеры расположенные непосредственно вблизи гена или даже внутри него. Однако, часто размер критической области локализации гена составляет несколько сантиморганид, кроме того существуют гены, имеющие генетический размер 3 — 5 сантиморганид (например ген дистрофина).

Для таких генов даже при использовании внугригенных маркеров величина ошибки составит 2 — 3% на мейоз. С возрастанием числа анализируемых мейозов ошибка будет накапливаться. Вообще, точный расчет генетического риска при проведении косвенной диагностики представляет собой довольно сложную математическую задачу. Типичная ошибка при проведении косвенной диагностики составляет 1 — 5% К недостаткам косвенной диагностики следует отнести необходимость семейного анализа и обязательную уверенность в клиническом диагнозе, так как ни подтвердить, ни опровергнуть его при использовании этих методов 1в отличие от прямых) невозможно. Кроме того, косвенные методы ДН К-диагностики могут быть применены только для монолокусных заболеваний и неэффективны для моногенных полилокусных болезней.

Действительно, для таких заболеваний существует несколько локусов, в которых необходимо проводить сегрегационный анализ и не ясно, какой из локусов выбрать. Косвенные методы не требуют знания структуры гена и спектра мутаций в нем. Необходимо только иметь сведения о его локализации. В этом сосюит основное преимущество этих методов. Кроме того, методы косвенной диагностики информативны практически для всех обратившихся семей, поскольку всегда есть возможность среди полиморфных маркеров, сцепленных с локусом заболевания, найти информативный для данной семьи.