В.И. Иванов - Генетика, страница 98

Таким обраюм, биохимические параметры можно считать ~ иибв ~се информативным описанием фс~ ютипа. Подтверждением этого являются биохимические показатели гетерозигот, значения которых часто занимают промежуточное положение между значениями у нор мал ьных и патологических гомозигот: например, гетерозиготные носители рецессивного аллеля фенилкетонурии симптомов заболевания не имеют, но реагируют на введение фенилаланина более сильным повышением концентрации этой аминокислоты в плазме, чем нормальные гомозиготы. К тому же не для всех наследственных заболеваний обнаружен молекулярно-генетический дефект или имеются возможности для его выявления.

В связи с этим, биохимические методы играют важнейшую роль в диагностике наследственных заболеваний, позволяя подтверждать диагноз в случае атипичной кли нической картины, проводить доклиническую диагностику и начинать лечение на ранних стадиях заболевания, выявлять гетерозиготных носителей, дифференцировать генетически различные формы болезни со сходной клинической картиной. Результаты диагностики гетерозиготного носительства биохимическими методами могут быть использованы в практике медико-генетического консультирования при расчетах риска рождения ребенка с наследственным заболеванием на основе вероятностных подходов. Предметом биохимической диагностики могут быть различные классы органических и неорганических веществ (аминокислоты, углеводы, липиды, мукополисахариды, ионы металлов и др.) и их метаболиты, концентрация и отклонения в активности ферментов.

Универсальность биохимической диагностики состоит в том, что исследовать этими методами можно любую ткань или секрет организма (мочу, пот, кровь, слюну, мышцы и др.). Это обусловливает многообразие биохимических методов и необходимость их непрерывного совершенствования, Безусловно, биохимические методы играют первоочередную роль в диагностике наследственных нарушений обмена веществ (НБО). Универсальность этих методов позволяет использовать их в дифференциальной диагностике и дЛя выявления гетерозиготного иосительства другой моногенной патологии, при которой изменение биохимических показателей является вторичным; например, при прогрессирующей мышечной дистрофии Дюшенна/Бекера (ПМДД/Б) повышается уровень креатинфосфокиназы (фермент мышц) в крови больных при начальной и развернутой стадии заболевания, а также и у 30% носительниц гена ПМДД/Б.

Для диагностики ряда состояний используют комбинированные биохимические методы. Так иммуно-генетическое тестирование позволяет поставить или уточнить диагноз при врожденных иммунодефицитных состояниях, при подозрении на анти- генную несовместимость матери и плода по тем или иным системам групп крови. Имиуво-гистохиглачесхий метод используется для выявления той или иной белковой субстанции в какой-либо ткани при помощи специфичных антител (именно так проводят дифференциальную диагностику поясно-ко нечн ости ых прогрессирующих мышечных дистрофий и ПМДД/Б: исследуют мышечные волокна на наличие или отсутствие в них дистрофина при помощи антител, специфичных для С-домена, йог)-домена и 1Ч-конца белка дистрофина). С каждым годом совершенствуясь, биохимические методы становятся все более сложными, многоступенчатыми, а, следгиительно, и дорогими.

Использовать их для Часнгь 1К зьгедицимскан еененгика 41(4 уаолица 19.3. Качественные тесты с мочой Днагноетируемые НБО Другие состояния, имеюиозе яолоннгсль- иые результаты теста Тест 3-Гидрокси-3-метилглутаровая ациаурия, алкаптонурия, изоналериановая ацидемия, лейциноз, тирозинемия, ФКУ, цисги нурия Алкаптонурия, врожденная непереносимость фруктозы, галактоземия, лактазнан недостаточность Анкаптонурия, гиперглицинемия, гистидинемия, лейциноз, тирозинемия, ФКУ Алкаптонурия, гиперглицинемия,гликогенозы, лейциноз, ФКУ Метилмалоновая ацилурия Недостаточность молибденового кофактора Алкаптонурия Органолептические (цвет, запах) Тест Бенедикта Диабет, синаром Фанкони, прием антибиотиков Гипербиллирубинемия; кетоацидоз, лактат-ацидоз; карциноматоз; меланома; феохромацитома; цирроз Лактат-ацидоз Тест с хлоридом железа Тест с динитрофенилпщ- разином Тест с р-нитроанил ином Сульфитный тест Тест на гомогентизиновую кислоту Тест с иитрозонафтолом Тирозиисмия, галактозе- мии и фруктозсмии ~ программ массового скрининга наследственных болезней, многие из которых встречаются в популяциях с сравнительно низкой частотой, невыгодно.

Необходимо предварительное опросеивание» популяции (гл. 25). Биохимические методы подразделяют на качественные, количественные и полу- количественные. Качественные реакции позволяют обнаружить избыточные концентрации субстратов блокированной ферментной реакции или их производных, накапливающихся при НБО. Качественные тесты чувствительны, просты в применении, отличаются низкой себестоимостью и не дают ложноотрицательных результатов, а информация, полученная с их помощью, позволяет с высокой долей вероятности заподозрить НБО у пациента.

Однако на результаты этих тестов влияет применение ряда лекарственных препаратов и их метаболитов, а также некоторых пищевых добавок. Качественные пробы бывают: универсальными (выделяется группа заболеваний, класс веществ; например, ЦПХ-тест для мукополисахаридов) и специфическими (на цистин-гомоцистин, метилмалоновую кислоту и др.). Наиболее распространены качественные тесты с мочой, вследствие доступности и простоты получения материала для исследования. Основные используемые для диагностики НБО качественные тесты с мочой представлены в табл. !9.3. Глооа Го и ~ > Фтиеоо>л оо, и оо>дологое 'и имело ° вв лстблаяа 19.4.

Классы веществ, выявляемые различными методами аваляза Методы авалова диализиррсмые илассы веществ Двумерная Одномерная Аминокислоты; имидазолы; моно- и дисахариды; пурины и пиримидины; фенальные кислоть> Аминокислоты; моно- и дисахариды; слигосахариды; сиаловые кислоты ТСХ ВЭЖХ ХМС Аминокислоты; пурины и пиримидины Органические кислоты; ОДЦЖК; холестерин; желчные кислоты Аминокислоты; ацилкарнитины Тандемная масс-спектро- метрия 1ТМС) Электрофорез гликоза- миногликанов Гликозаминогликаны Полуколичестоенные и количественные тесты проводятся как с мочой (тест с цианид-нитропруссидом — гомоцистинурия, цистинурия; ЦПХ-тест — мукополисахаридозы), таки с кровью (газы крови, глюкоза, ионы аммония, молочная кислота, кето- новые тела, пировиноградная кислота, холестерин, триглицериды) и могут иметь различную степень сложности.

Наиболее простые из них, такие как измерение ко» центрации лактата, пирувата, кетоновых тел, ионов аммония, а также определение кислотно-щелочного равновесия, позволяют планировать дальнейшую тактику дищ пестики: так метаболический ацидоз служит показанием для проведения газовой хро матографии (ХМС) с целью исключения органических ацнаурий, а повышение кон центрации ионов аммония — для исключения дефектов цикла мочевины; определю ни концентрации кетоновых тел и соотношения концентраций лактат/пируват в крови >ш ляется первым этапом для дифференциальной диагностики митохондриальных бале > ней.

Конечно, решающее значение в диагностике нарушений обмена играяп более сложные и высокоточные количественные методы, такие как флуоримстричсскис хроматомасс-спектрометрия, спектрофотометрия, различнЫе виды хроматографи> и электрофорез гликозаминогликанов (ГАГ) Все эти методы можно услощ ю ра цс лить на две группы: методы позволяющие получить спектр какого-либо класса вс шеста, например аминокислот, н методы для определения концентрации конкретно го вещества, например фенилаланина или тирозина (флуориметрический метол) Хроматографические методы, как правило, дают информацию о спектре и количссг ве веществ (табл.

19.4). Тонкослойная, колоночная и др. виды хроматографии применяются для вьщслс ния и очистки анализируемых соединений, а также для получения резульглтов»а н< > луколичественном уровне. Так, тонкослойную хроматографию используют лля вь> явления дефектов обмена пуринов и пиримидинов, углеводов, аминокислот, олин> сахаридов и гликозаминогликанов (мукополисахаридов). Метод не требует специ альп ого дорогостоящего оборудования, интерпретация результатов довольно и рос н а стоимость одного анализа невысока, что иногда позволяет использовать эпп мои > и на первом этапе скрип инга (гл. 25).

Более того, п оскол ьку тои косл ой ноя хро матс 406 Чаегяь 14 яеедииинская генегяика 7ибляда 19.5. Диагностика наследственных болезней обмена с помощью различных методов яяализа Класс НБО Аминодцидопатии Определяемые метпбояпты Метод ппядпэп Аминокислоты, птеридины" Амин окислатный анализатор, ВЭЖХ, ТМС ВЭЖХ Лактат, пируват, 3-гидрокси- бугират, ацетоацетат Органические кислоты ХМС, ВЭЖХ, ТМС Пурины, пиримидины, мочевая кислота Моно- и дисахариды ВЭЖХ, ХМС, ТМС 11сроксисомные болез- ни ВЭЖХ ВЭЖХ ВЭЖХ Моно- и дисахариды Холестерин и ега произвол- ныс, триацилглицериды Катехаламины, аминокис- лоты Порфирины ВЭЖХ Стероидные и тиреоидные гармонь~ ' — прм зпокачествеинай ФКУ, используется только ВЭЖХ.

ГХ вЂ” газовая хроматография; ХМС вЂ” хроматомосс-спехтраметрия; ТМС вЂ” тандемная мосс-спехтра- метряя Опрслсленяс уровня ОДЦ7КК включает в себя следующие этапы. внесение в пробу внугреннега стшлпрта (метилсваго эфира кислоты С27); выделение липиднай фракции; этерифихацмя жирных кислот в соответствующие метиловые эфиры; выделение последних препаративной тоикослойнай хроматографией и анализ полученной фракции на газоном хроматаграфе. граф ия в зависимости ат класса используемой аппаратуры может быть качественной, полукаличественнай и количественной, ана может применяться на разных этапах скрининга.