Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения, страница 6

Эти реакции обычно завершаются незначительным увеличениемгидрофильности молекулы [151].35Процессы 2-й фазы биотрансформации включают глюкуронирование,сульфатирование, ацетилирование, метилирование, а также конъюгацию саминокислотами и глутатионом. Эти процессы обычно завершаютсяувеличением гидрофильности и элиминации [152].Процессыбиотрансформациимногочисленныхсоединенийкатализируются ограниченным числом ферментов. В некоторых случаяхсинтез этих ферментов усиливается при абсорбции вещества (индукцияфермента), но обычно внешние факторы не влияют на процесс синтезафермента.Ферменты биотрансформации распределены по всему организму иприсутствуют в основном в микросомах и в цитозоле; незначительная частьферментов локализуется в митохондриях, ядре и лизосомах (табл.

6) [153].Таблица 6 – Основные реакции биотрансформации БАВ и их локализация [153]РеакцияФерментЛокализация1-я фазаГидролизЭстеразаМикросомы, цитозоль, лизосомыПептидазаЛизосомы, внеклеточно в кровиЭпоксид гидролазаМикросомы, цитозольФерменты восстановленияМикросомы, цитозоль, в составеазо-(-N=N-) и нитро- (-NO2) труппмикрофлорыФерменты восстановленияЦитозоль, микросомыкарбонильной группы (С=O)Ферменты восстановленияЦитозольдисульфидов (RS-SR)ВосстановлениеФерменты восстановленияЦитозольсульфоксидов (R2S=O)Ферменты восстановленияМикросомы, цитозоль, митохондриихиноновФерменты восстановительногоМикросомыдегалогенированияОкислениеАлкогольдегидрогеназаЦитозольАльдегиддегидрогеназаМитохондрии, цитозольАльдегидоксидазаЦитозольКсантиноксидазаЦитозоль36РеакцияФерментЛокализацияМоноаминоксидазаМитохондрииДиаминоксидазаЦитозольПростагландин - Н - синтетазаМикросомыФлавин-монооксигеназаМикросомыЦитохром Р450Микросомы2-я фазаФерменты конъюгации сглюкуроновой кислотойФерменты конъюгации ссульфатомФерменты конъюгации сглутатиономФерменты конъюгации саминокислотамиМикросомыЦитозольЦитозоль, микросомыМитохондрии, микросомыАцетилированиеМитохондрии, цитозольМетилированиеЦитозоль, микросомыУ позвоночных печень – наиболее богатый источник ферментов,катализирующихреакциибиотрансформации.Ферментынаходятвжелудочно-кишечном тракте, легких, почках, коже, слизистой оболочке носа,в тканях глаза и других тканях.

Важную роль в метаболизме некоторыхсоединений играет кишечная микрофлора.Таким образом, биотрансформация осуществляется преимущественно впечени, но может проходить в стенке желудка и кишечника, в почках, сердце,легких, мозге и в крови. Все изменения токсичных веществ до поступления всистемный кровоток называются пресистемным метаболизмом. Некоторыесоединения, достигнувшие кровяного русла, подвергаются изменению всамой крови (табл. 6) [154].Впоследниедействующихдесятилетиякомпонентовпроблемалекарственныхопределениярастенийметаболитоввсложныхбиологических матрицах приобретает всё большую актуальность [155-160].Методы обнаружения и идентификации метаболитов можно разделить на три37основные категории [131].

Если известны или предсказуемы метаболическиереакции, например такие как гидроксилирование или деалкилирование, тометаболиты можно обнаружить по молекулярным массам [161-163]. Ковторой категории относятся методы анализа, основанные на данных массспектрометрии высокого разрешения (на основании дефектов масс [161-166],cиспользованиемизотопногофильтра[167,или168]вычитанияфона [161-163, 169, 170]). Третья категория включает в себя метод тандемноймасс-спектрометрии(регистрацияион-продуктов[161-163,171],нейтральных потерь [161-163]). После того, как метаболит был обнаруженоднимизвышеуказанныхспособов,егоструктураможетбытьидентифицирована в соответствии с правилами фрагментации данного классасоединений [162-165]. Определение изотопного состава может такжеиспользоваться при идентификации метаболитов [172].Результаты исследований метаболических процессов флавоноидовгорянки в опытах на лабораторных животных, полученных с использованиемразличных инструментальных методов анализа, таких как капиллярныйэлектрофорез, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) сУФ-детектированием или в сочетании с тандемной масс-спектрометрией,представлены в работах [132, 135, 144, 145].

Однако данные методыоснованынаопределениисоединенийсизвестнойструктуройиподразумевают наличие СО аналитов. В работе [173] исследовалиметаболизм одного из флавоноидов горянки – икаритина. В качестве объектаисследования выбрали образцы плазмы и мочи крыс после жидкостножидкостнойэкстракцииэтилацетатом.Длявыявлениявозможныхметаболитов сравнивали хроматограммы в режиме сканирования в заданномдиапазоне масс биологических образцов после перорального введения сбланковыми.Обнаруженныесоединенияподвергалисьдиссоциации,индуцируемой соударением.

По полученным фрагментам устанавливалиструктуры метаболитов. Таким образом, были выявлены следующиепроцессыбиотрансформацииикаритина:глюкуронирование,38гликозилирование,окисление.сульфатация,Основнымидеметилирование,недостаткамиданногогидрированиеподходаиявляютсяограниченность, связанная с трудностями идентификации метаболитовмалыхконцентраций,трудоёмкость,вызваннаянеобходимостьювнимательного и долгого поиска различий в хроматограммах биологическихобразцов и бланковых.В работах [130, 134, 174] предложен способ идентификацииметаболитов флавоноидов горянки с использованием ВЭЖХ в сочетании стандемной масс-спектрометрией высокого разрешения (многомерная массспектрометрия) с применением алгоритмов зависимого сканирования.

Вработах выявлено, что дегликозилирование и глюкуронирование являетсяосновными фазами биотрансформации флавоноидов горянки. Однако этотметод не является селективным по отношению к метаболитам биологическиактивных веществ горянки и обработка полученных инструментальныхданных без соответствующего программного обеспечения в ручном режимеявляется сложной задачей, сопряжённой с большими временными затратами.Большое исследование провели авторы работы [131]. Они предложилиновую стратегию открытия и идентификации метаболитов с помощью ВЭЖХс масс-спектрометрией высокого разрешения и способа, основанного насходстве масс-спектральных деревьев. Потенциальные метаболиты былиобнаружены на основе сходства их спектральных деревьев с известнымисоединениями или метаболитами.

Данный подход состоял из четырёх этапов.Первый заключался в получении МСn-спектров (n=1-3) в режиме зависимогосканированияспредварительноустановленнымиинтенсивностейионов-предшественников.Второйэтапзначениямисостоялвпреобразовании полученных данных в масс-спектральные деревья. Третийшаг заключался в создании библиотеки. Четвёртый этап состоял в сравненииэкспериментальных масс потенциальных метаболитов с теоретическимизначениями. С помощью этого способа авторам удалось идентифицировать115 метаболитов.

Следует отметить, что авторы работы не привели все39структуры обнаруженных соединений. А данный подход имеет рядсущественныхнедостатков:во-первых,необходимоиспользованиеспециального программного обеспечения для создания масс-спектральныхдеревьев, во-вторых, для идентификации метаболитов необходимо получитьчистые тандемные спектры аналитов, что сложно реализовать при анализетаких многокомпонентных биологических матриц, так как вследствиебольшогоколичествапроисходитсоединений,перекрываниеималойискажениеконцентрацииметаболитовмасс-спектров.Необходимопроведение серьёзной подготовки проб для избавления от мешающихкомпонентов, однако авторы проводят только осаждение белков метанолом,концентрирование в токе азота, высокоскоростное центрифугирование ианализ надосадочной жидкости.

В работе исследователями с помощьюфильтранейтральныхложноположительныхфильтрапотерьвыявленорезультатов.Возможно,приполучениитандемныхцелесообразно,посколькупозволитполучаемыхмасс-спектральныхложноположительныезначительноинесколькоиспользованиемасс-спектровданныхрезультаты.толькоприОтсутствиеданногобудетболеесократитьобъёмэтомисключитьинформацииочувствительности и селективности предложенного метода, не позволяетоценить корректность предложенного способа.Таким образом, необходима разработка селективного метода с высокойчувствительностью и экспрессностью для обнаружения не только мажорных,но и минорных метаболитов флавоноидов горянки в моче крыс.В последние годы для автоматизированного поиска метаболитов всёчаще используют различные варианты специализированного программногообеспечения, позволяющего из значительных по объему массивов хроматомасс-спектрометрических данных в автоматическом режиме извлекатьхарактеристические ионы, соответствующие продуктам биотрансформацииисследуемыхсоединений.Соответствующиепрограммныепакетыпредлагаются ведущими производителями хроматографического и масс-40спектрометрического оборудования: Thermo MetWorks, Agilent MassHunterMetabolite ID, Waters MetaboLynx, Shimadzu MetID Solution.

Общий алгоритмработы этих программ состоит в следующем: в качестве исходных данныхиспользуются масс-хроматограммы, полученные в результате анализаконтрольного (до приема препарата) и опытного (после приема препарата)образцов биологических жидкостей.

Данные могут обрабатываться как впаре (контроль-опыт), так и в виде пакетов (все контрольные – все опытныеобразцы, включая данные повторных анализов одних и тех же проб). Также впрограмму вводится брутто-формула исследуемого соединения для расчетаего точной массы и/или результаты его хроматомасс-спектрометрическогоанализа в чистом виде или в виде использованной в экспериментахлекарственной формы. В зависимости от возможностей применяемогооборудования и метода анализа программное обеспечение формируетперечень обнаруженных метаболитов с учётом уровня их статистическойдостоверности путём сравнения значений точных масс ионов, характера ихфрагментации и проверки изотопных соотношений. При этом используютсяинтегрированныебазыданныхтрансформацииксенобиотиковвосстановления,гидролиза,фосфорилирования,овозможныхпутяхвразличныхреакцияхалкилирования,сульфатирования,биохимической(окисления,деалкилирования,глюкуронирования,карбоксилирования и др.).MetQuestтакжепозволяетработатьсбольшимобъёмомэкспериментальных данных.