Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения, страница 5
Описание файла
PDF-файл из архива "Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "химия" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата химических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст 5 страницы из PDF
koreanumJiweiling –лиофилизированный порошок,содержащийэкстрактженьшеня игорянкиE. koreanum,E. sagittatumE. brevicornum,E. koreanum,E. pubescence,E. sagittatum,E. wushanense,E. acuminatum,E. myrianthum,E. truncatum,E. davidii,E. membranaceumИдентифицированныесоединенияНеподвижнаяфаза;подвижная фаза;Детекторскорость потока;объём вводимойпробыДиапазондетектируемыхмасс (режимионизации*), Стіп, Литеэнергиянг/мл ратурафрагментации,ионныепереходыRP1851 активный(100 × 2,1 мм,компонент, в1,7 мкм);том числе:0,3% раствор(-), 25 ВESIикариин,муравьиной721,23→367,12MC/МСэпимедин А, кислоты в воде:837,28→367,12эпимедин В,ацетонитрил;807,27→367,12эпимедин С0,25 мл/мин;821,29→367,122-10 мклZorbax EclipseXDB-С18(4,6 × 150 мм,(-)0,57Икариин,5 мкм);721,2→513,10,50иперин,0,1 % растворESI463,1→300,01,08эпимедин А,муравьинойMC/МС 837,2→675,21,10эпимедин В, кислоты в воде:807,3→645,21,01эпимедин Сацетонитрил;821,3→659,20,7 мл/мин;20 мклCapcell Pak C18(150 × 2,0 мм,5 мкм);5мМ формиат(+)Икариин,аммония в воде677→369иперин,(pH 4,0): 90%ESI465→303менееэпимедин А, ацетонитрил с MC/МС839→369500эпимедин В, 5 мМ формиатом809→369эпимедин Саммония823→369(pH 4,0);0,3 мл/мин;10 мкл(+)Баохуозид I,515Zorbax SB-С18икариин,677(100 × 2,1 мм,сагиттатозид B,6473,5 мкм);”2 -О-рамнозил0,3% растворикаризид II,6613,7 –уксуснойESI-MCэпимедин А,8399,1кислоты в воде:эпимедин В,809ацетонитрил;эпимедин С,8230,2 мл/мин;кверцетин3035 мкл(внутреннийстандарт)[35][36][38][37]30Объект анализаИдентифицированныесоединенияНеподвижнаяфаза;подвижная фаза;Детекторскорость потока;объём вводимойпробыДиапазондетектируемыхмасс (режимионизации*), Стіп, Литеэнергиянг/мл ратурафрагментации,ионныепереходы29 фенольныхсоединений, втом числе:Zorbax SB-С18(-), 25 Вгександразид Е, (250 × 4,6 мм,677→515→352икариин,5 мкм);721→513→366икаризид I,0,1 % раствор529→367→352ESIE.
koreanumикаризид II,муравьиной513→366→351[127]MC/МСкаохуозид А, кислоты в воде:963→801→367каохуозид B,ацетонитрил;963→801→367эпимедин А,1,0 мл/мин;873→675→367эпимедин В,10 мкл843→645→366эпимедин С,857→659→366эпимедозид A661→353→298Примечание – * – режим ионизации: (+) - режим регистрации положительно заряженныхионов, (-) - режим регистрации отрицательно заряженных ионовЧаще всего для определения флавоноидов горянки используютобращенно-фазовыйвариантВЭЖХ.Вкачественеподвижныхфазприменяют различные гидрофобные сорбенты с привитыми алкильнымирадикалами (табл. 5).
В большинстве случаев используют колонки сосферическими частицами сорбента диаметром 5 мкм, а иногда и менее 2 мкм(метод ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии) [35, 39].Использование сорбентов с диаметром зерен не выше 2 мкм, позволяетсократить продолжительность анализа.Разделение флавоноидов проводят, как правило, при элюированиисмесями ацетонитрил-вода или метанол-вода с небольшим содержаниемуксусной или муравьиной кислот [36, 40, 41].
Эти подвижные фазы удобныдля разделения сложных смесей как флавоноидов, так и их гликозидов вусловиях градиентного элюирования [39-41].В качестве детекторов при определении действующих веществ горянкиметодомВЭЖХиспользуютспектрофотометрические [41],матричные [39, 40, 52], масс-спектрометрические [36, 37, 127].диодно-31Спектрофотометрическое детектирование обычно проводят при 270 нм.С использованием метода ВЭЖХ-УФ исследовали пять видов горянки [128].Наибольшее количество флавоноидов обнаружено в листьях горянки, затем вкорнях инаименьшее в стеблях. Авторы работы [41]исследовали10 представителей E.
brevicornum, собранных во время цветения в различныхместах Китая. Все образцы имели гораздо большее содержание действующихвеществ (икариина 8,5 – 39,9 мг/г, эпимедина А 2,3 – 8,4 мг/г, эпимедина В6,7 – 55,7 мг/г, эпимедина С 5,4 – 23,0 мг/г, общее содержание целевыхвеществ 29,1 – 123 мг/г), чем указано в китайской фармакопее (дляикариина – 5 мг/г, общее содержание флавоноидов – 13 мг/г), что можетнегативно отразиться на безопасности биологически активных добавок илилекарственных средств на основе экстрактов горянки. Таким образом,контроль качества растительного сырья является важной и актуальнойзадачей.При определении флавоноидов также применяют одновременнуюрегистрациюпринесколькихдлинахволн-диодно-матричноедетектирование [39, 40, 52].
Пределы обнаружения флавоноидов в такомслучае обычно составляет 45 – 131 нг/мл. В работе [40] предложен способавтоматизированнойклассификации,упрощающийморфологическуютаксономию видов Epimedium, с помощью ВЭЖХ с диодно-матричнымдетектированием. С помощью предложенного подхода возможно различитьдва схожих между собой вида Epimedium koreanum и wushanense [129].В последние годы для идентификации и определения флавоноидов,присутствующих в лекарственных растениях и продуктах питания, все чащеиспользуют метод ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием(ВЭЖХ-МС) в условиях ионизации электрораспылением [37].
Действующиевещества горянки исследуют как в режиме регистрации положительнозаряженных [38], так и отрицательно заряженных ионов [36]. В первомслучаефлавоноидычащевсегообразуютпротонированные32молекулы [M+H]+, а во втором – депротонированные молекулы [M-H]- иаддукты [M+2H2O-H]-, [M+HCOOH-H]-[36, 127].Идентификация или подтверждение подлинности соединения – первыйи важнейший шаг для создания количественного анализа. Информацию оструктуре вещества можно получить с использованием тандемных массспектрометров [36, 127], а масс-спектрометрия высокого разрешения даетточную массу для определения брутто-формулы аналита [35].Спомощьютандемноймасс-спектрометрииисследованыпутифрагментации фенольных соединений горянки [127].
Установлено, что путифрагментации 3-О-, 7-О-, и 3,7-ди-О-гликозидов отличаются. Кроме того, спомощьюразработанногоЖХ-МС/МСметодапроанализированораспределение флавоноидов в семи видах горянки.С использованием метода ВЭЖХ-МС/МС контролировали качествопрепарата Jiweiling, представляющего собой лиофилизированный порошок,содержащий экстракт женьшеня и горянки [36]. С помощью ВЭЖХ–MC/МСобнаружено 15 активных компонентов, содержащихся в этом лекарственномсредстве.1.5 Определение флавоноидов горянки в биопробахПритрадиционномподходеустановлениеособенностейфармакокинетики лекарственных средств проводится с использованиемстандартных процедур подготовки биологических жидкостей, как правило,мочи или сыворотки (плазмы) крови, к анализу содержания биологическиактивныхвеществ(БАВ)иихметаболитов.Данныепроцедурыпредполагают разбавление проб, корректировку их рН (подкисление,подщелачивание), экстракцию и повторную экстракцию (реэкстракцию)органическими растворителями, упаривание и химическое осушение,фильтрацию,последующуюдополнительнуюобработкуфракцийвзависимости от кислотности определяемых соединений.
Для определенияфлавоноидов горянки подготовка проб образцов мочи включает в себя33обессоливаниеорганическимрастворителем(ацетонитрилом[130],метанолом [131]) или разбавление водой [132]. Образцы желчи, сыворотки(плазмы)кровиподвергаютжидкостно-жидкостнойэкстракцииэтилацетатом, после чего органический слой упаривают досуха в токе азота иостатоквосстанавливаютподвижнойфазой[133-136]илиметанолом [137-141]. При исследовании фармакокинетических профилей ираспределения по органам и тканям икариина [142] и икаритина [143]извлекают селезенку, почки, печень, легкое, сердце и головной мозг.Образцы тканей гомогенизируют и экстрагируют аналиты ацетонитрилом.В настоящее время для определения флавоноидов горянки вбиологическихобразцахприменяютхроматографическиеметодысоспектрофотометрическим детектированием в УФ-области [130, 144] икапиллярный зонный электрофорез [145], которые требуют обязательногоналичия СО.
При этом их чувствительность и достоверность идентификациидостаточно низкая в сравнении с масс-спектральными методами анализа, апродолжительность анализа высокая.В последние годы для идентификации и определения исследуемыхсоединений в биологических образцах все чаще используют методВЭЖХ-МС (МС/МС) в условиях ИЭР [133, 137, 139, 146, 147]. Так в работе[137]данныйметодиспользовалиприизучениифармакокинетикифлавоноидов после приема стандартизованного экстракта Epimedium. Врежиме мониторинга заданных реакций при регистрации отрицательнозаряженных ионов установили, что максимальная концентрация икариина иикаризида II в крови достигается через 0,5-1 ч, а икаризида I, икаритина идесметиликаритина – через 8 ч.
Такие же результаты были полученыавторами работы [133, 148] при регистрации положительно заряженныхионов. Нижний предел количественного определения икариина в сывороткекрови составил 10 пг/мл [149]. Подготовка проб включала в себя проведениедериватизации (рис. 4), а детектирование осуществлялось в режиме34мониторинга заданных реакций при регистрации положительно заряженныхионов перехода m/z 910→764.Рис.
4. Схема химической реакции дериватизации икариина [149].Таким образом, применение метода ВЭЖХ-МС (МС/МС) дляопределения флавоноидов горянки в биологических образцах представляетсяперспективным.1.6 Исследования метаболизма флавоноидов горянкиБиотрансформация – метаболическое превращение эндогенных иэкзогенныххимическихвеществчащевсеговболееполярные(гидрофильные) соединения. Обычно при биотрансформации свойства БАВизменяютсялипидныеотлипофильных,мембраны,кблагоприятствующихгидрофильным,абсорбцииспособствующимчерезпочечнойэкскреции. Исключение из этого общего правила – выведение липофильныхлетучих соединений через органы дыхания. Изменение химической формывещества при биотрансформации приводит и к изменению его биологическойактивности [150].Биотрансформация большого числа соединений разных химическихклассов протекает с использованием ограниченного числа ферментов.Процессы 1-й фазы биотрансформации – гидролиз, восстановление иокисление.