Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения, страница 4

1).В табл. 3 приведены полученные результаты. Стоит отметить, что вкачестве внутреннего стандарта использовали рутин.Данные результаты согласуются с результатами работы [98].В последнее время широкое внимание привлекла капиллярнаяэлектрохроматография (КЭХ) [99-108]. Это гибридный метод, сочетающийпринципы КЭ и ВЭЖХ. В КЭХ движение подвижной фазы через колонкусоздаётся за счёт приложенного вблизи концов капилляра электрическогополя вследствие электроосмоса, а разделение аналитов происходит каквследствие различия в их электрофоретической подвижности, так ивследствие их различного взаимодействия с неподвижной фазой.22Рис.

1. Электроферограмма, полученная методом КЗЭ с 50 мМ боратным буфером(рН 10.0) с 22 % ацетонитрила, капилляром 56 см × 75 мкм, с напряжением 15 кВ,температурой 25 °С, с инжекцией образца под давлением 50 мбар × 5с, с детектированиемпри длине волны 270 нм: (А) стандартного образца из 4 флавоноидов, (В-D) Epimediumsagittatum, (E) Epimedium pubescens, (F) Epimedium wushanense и (G) общий экстрактфлавоноидов Epimedium, где 1 - эпимедин B; 2 - эпимедин A; 3 - эпимедин C; 4 - икариин,IS – рутин [97].Таблица 3 – Содержание флавоноидов в различных образцах горянки (мг/г) [97]№п/п123456ОбразецЭпимедин BЭпимедин АЭпимедин СИкариинE. sagittatum Maxim.E. sagittatum Maxim.E.

sagittatum Maxim.E. pubescens Maxim.E. wushanense T.S.YingОбщий экстрактфлавоноидов Epimedium1,45,73,03,76,02,26,94,27,89,316,926,958,44,814,45,416,36,93,06,439,072,4125,1172,123КЭХ имеет ряд принципиальных достоинств по сравнению с другимихроматографическими методами: малый расход реагентов и растворителей,отсутствие насосов высокого давления и простота управления потокомподвижной фазы с помощью изменяемого напряжения, высокая скоростьразделения [109]. Всё это стимулирует внедрение КЭХ в практикуаналитических работ, поэтому круг объектов, анализируемых этим методом,достаточно широк, в том числе включает флавоноиды из некоторыхрастительных лекарственных трав [110-112].Описан метод КЭХ [47], позволяющий одновременно определить семьфлавоноидов: гександразид Е и F, кемпферол-3-О-рамнозид, икариин,эпимедин А, B, С и внутренний стандарт - байкалеин.

Исследовано влияниетаких параметров, как концентрация буферного раствора, pH и содержаниеацетонитрила. Необходимое разделение (рис. 2) получили при использованиикапилляра Hypersil C18 (3 мкм, 100 мкм × 25 см) и подвижной фазы,состоящей из 20 мМ фосфатного буферного раствора (рН 4.0): ацетонитрила(70: 30 по объёму) при 30 кВ и 25 °С в течение 20 мин. Предел обнаруженияи минимально определяемое содержание составили 8,6 и 42,8 мкг/млсоответственно.В табл. 4 представлены полученные результаты.Таблица 4 – Содержание исследуемых компонентов в горянке (мг/г) [47]№п/п123ГексанОбразецдразидЕE.brevicornum1,0E. sagittatum*-Кемпферол-3-орамнозид0,6ГександразидF2,1-9,4E.wushanense0,82,7E.

pubescens4+**1,2ГуансиE. pubescens5+0,8Сычуань6 E. koreanum+* аналит не обнаружен,** содержание аналита ниже предела определения.Эпимедин АЭпимедин BЭпимедин CИкариин1,12,71,92,71,10,76,81,31,51,224,12,91,71,95,46,32,22,910,52,82,32,81,65,724Рис. 2.

Капиллярные электрохроматограммы (A) смеси стандартных растворов иэкстрактов (B) E. brevicornum, (C) E. sagittatum, (D) E. pubescens из Гуанси, (E)E. pubescens из Сычуань, (F) E. wushanense и (G) E. koreanum, где 1 - гександразидЕ, 2 - кемпферол-3-о-рамнозид, 3 - гександразид F, 4 – эпимедин А, 5 - эпимедин B,6 - эпимедин C, 7 – икариин, 8 – байкалеин [47].25Согласно данным, содержания семи исследуемых флавоноидовзначительно отличаются между видами Epimedium, что может бытьобъяснено различными местами произрастания, временем сбора и условиямихранения.

Данные табл. 2-4, указывают на необходимость контроля качестварастительного сырья для проведения его стандартизации.При сравнении двух методов следует отметить, что КЗЭ в отличие отКЭХ требует меньше времени, экономических затрат и техническогообслуживания.1.4.3 Газовая хроматографияГХ используют для разделения газообразных, жидких и твёрдыхвеществ, которые должны удовлетворять определённым требованиям,главное из которых – летучесть. Если же соединение не обладает даннымсвойством, то предварительно проводят дериватизацию [113-115]. Еёприменение приводит к получению более летучих соединений, снижениюполярностифункциональныхгрупп,икакследствие,улучшениюхроматографических свойств веществ [116-118].

Наиболее популярнымдетектором в ГХ является пламенно-ионизационный. Однако в последнеевремя всё большую популярность приобретает комбинация ГХ и МС.Обычнодляполученияпроизводныхфлавоноидовприменяюттриметилсилильные реагенты [119]. В работе [30] для определения икариинаи десметиликаритина в качестве дериватизирующих агентов использовалибис(триметилсилил)-N,O-трифторацетамид(БСТФА)иN-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамид (МСТФА) и обнаружили, что продуктыдериватизации с первым реагентом более стабильны (> 48 ч). В качествекатализатора для полного завершения реакции использовали пиридин(БСТФА: пиридин в соотношении 4: 1). Также провели исследования дляопределения оптимального времени дериватизации, которое составило60 мин.

При 30 мин обнаружили промежуточные продукты (рис. 3).26Рис. 3. Хроматограммы по полному ионному току ТМС-производных генистеина(внутреннего стандарта), икаритина и десметиликаритина после дериватизации втечение: а – 5 мин, b – 30 мин, с – 60 мин, где 1 – три-ТМС-производноегенистеина, 1' – два-ТМС-производное генистеина, 2 – три-ТМС-производноеикаритина, 2' - два-ТМС-производное икаритина, 3 – четыре-ТМС-производноедесметиликаритина, 3' – три-ТМС-производное десметиликаритина [30].В последние годы ГХ методы анализа становятся менее популярными,что отражается в снижении количества публикаций. Поскольку дляопределения флавоноидов горянки необходимо проведение дериватизации,увеличивающей время анализа, данный метод редко применяется висследованиях растений рода Epimedium.1.4.4 Высокоэффективная жидкостная хроматографияВЭЖХ в сочетании с различными способами детектирования являетсяодним из наиболее эффективных для идентификации, разделения иопределения активных компонентов растений [120-125].

Общие сведения обопределенииактивныхкомпонентовгорянкиметодомВЭЖХ27систематизированы в табл. 5. Рассмотрим более подробно отдельныепримеры.Таблица 5 – Определение флавоноидов горянки методом ВЭЖХОбъект анализаE. brevicornumE. koreanumE. koreanum,E. brevicornum,E. pubescence,E. wushanense,E. sagittatumE. brevicornum,E. sagittatum,E.

pubescence,E. wushanense,E. koreanum,E. acuminatum,E. myrianthum,E. franchetii,E. stellulatum,E. zhushanense,E. lishihchenii,E. davidiiE. fargesiiИдентифицированныесоединенияИкариин,эпимедин А,эпимедин В,эпимедин СИкариин,икаризид I,эпимедин А,эпимедин В,эпимедин СИкариин,эпимедин А,эпимедин В,эпимедин СНеподвижнаяфаза;подвижная фаза;Детекторскорость потока;объём вводимойпробыZorbax SB-C8(250 × 4,6 мм,5 мкм);ацетонитрил:36% уксуснаякислота в воде(4: 100);1 мл/мин; 5 мклZorbax ODS C18(250 × 4,6 мм,5 мкм);вода:ацетонитрил;0,8 мл/мин;10 мклZorbax EcllipsePlus-C18(250 × 4,6 мм,5 мкм);метанол:ацетонитрил:0,5 % растворуксуснойкислоты в воде;1 мл/мин;20 мклДиапазондетектируемыхмасс (режимионизации*), Стіп, Литеэнергиянг/мл ратурафрагментации,ионныепереходыУФ,272 нм--[41]ДМД,270 нм;ESIMC/МС50-2000 Да (+),677→531→369531→369→313839→677→531809→677→531823→677→531-[56]ДМД,270 нм--[40]-12011050110110130130[39]Баохуозид I,баохуозид II,баохуозид VII, Acquity BEH C18гександразид Е, (50 × 2,1 мм, 1,7гександразид F,мкм);икариин,50 мМ растворДМД,каохуозид C,уксусной270 нмкемпферол-3-О- кислоты в воде:рамнозид,ацетонитрил;”2 -О-рамнозил 0,25 мл/мин;икаризид II,1 мклсагиттатозид A,сагиттатозид B,1201201305028Объект анализаE.

hunanenseE. leptorrhizumE. platypetalumE. sutchuenenseE. koreanum,E. wushanenseE. elatumE. brevicornum,E. sagittatum,E. pubescence,E. wushanense,E. koreanum,E. acuminatum,E. myrianthum,E. franchetii,E. stellulatum,E. zhushanense,E. lishihchenii,E. davidiiИдентифицированныесоединенияНеподвижнаяфаза;подвижная фаза;Детекторскорость потока;объём вводимойпробыэпимедин А,эпимедин В,эпимедин С,эпимедозид СИкариин,эпимедин А,XB-С18эпимедин В,(250 × 4,6 мм,эпимедин С,5 мкм);сагиттатозид B, 0,05 % раствор2”-О-рамнозилфосфорнойикаризид II, кислоты в воде:ангидроацетонитрил;икаритин,1,0 мл/мин;эпимедо10 мклкореанозид IZorbax Eclipseplus RP-С18Икаризозид С,(250 × 4,6 мм,баохуозид II,5 мкм);эпимедозид Aвода:эпимедин А,ацетонитрилэпимедин В,(75: 25);эпимедин С,0,5 мл/мин;икариин5 мклБаохуозид I,баохуозид II,баохуозид VII,гександразид Е,гександразид F,икариин,Zorbax SB-C18каохуозид C,(250 × 4,6 мм,кемпферол-3-О5 мкм);рамнозид,вода:”2 -О-рамнозил ацетонитрил;икаризид II,1 мл/мин;сагиттатозид A,10 мклсагиттатозид B,эпимедин А,эпимедин В,эпимедин С,эпимедозид СДМД,270 нм;Диапазондетектируемыхмасс (режимионизации*), Стіп, Литеэнергиянг/мл ратурафрагментации,ионныепереходы5012050120-(+)842→531→369501→355ДМД,664→356270 нм;840→531→370ESI-MC810→531→369824→531→369678→369-8,518,3136,055,128,548,017,7[129][126]47110123454550130ДМД,270 нм;ESI-MC100-1000 Да (+) 46для подтвер120ждения1314651474947[52]29Объект анализаE.