Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения, страница 22

Виалы плотно закрывают крышками и помещают в автосамплерхроматографа и анализируют по 0,003 мл каждого ГР, начиная с ГР10 (с163меньшей концентрации). Измерения проводят при условиях, указанных вп. 10.5.Для выполнения параллельного определения из виал снова отбираютпо 0,003 мл каждого из ГР и повторно анализируют. Измерения для каждогоиз ГР выполняют не менее двух раз и с использованием программногообеспеченияXcalibur2.2получаютзависимостьплощадейхроматографических пиков икариина, икаритина, икаризида I, икаризида II,эпимедина А, эпимедина В и эпимедина С от их концентраций в ГР.Градуировочные характеристики должны быть линейными во всемдиапазоне измеряемых концентраций с коэффициентами корреляции неменее 0,99, которые определяются автоматически без вмешательстваоператора.Градуировочныехарактеристикипроверяютсяежедневнопутемвведения любых двух ГР (ГР №№ 1-10) и измерения в них концентрацииикариина, икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А, эпимедина В иэпимедина С по градуировочным характеристикам.

Отношение разностиизмеренного и табличного значений к табличному значению содержанияикариина, икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А, эпимедина В иэпимедина С для каждого из этих ГР не должно превышать ± 10 %. В случаепревышения заданной величины градуировочная характеристика строитсязаново. Градуировочные характеристики строят заново также послепроведения технического обслуживания прибора и смены партий реактивов.Перед выполнением анализа исследуемого образца необходимопроанализировать «холостую» пробу (пробу растворителя, заведомо несодержащуюанализируемыхсоединений),чтобыудостоверитьсявотсутствии помех, вызванных загрязнениями аналитической системы,посуды и реактивов.16410.7 Контроль аналитической системыВ соответствии с руководством по эксплуатации прибора, в началекаждого рабочего дня масс-спектрометрическую систему проверяют спомощью автоматического теста.

Суть теста состоит в том, что в результатенастройки необходимо получить масс-спектр калибровочного вещества.Система обработки данных автоматически выполняет тест до тех пор, покане будут достигнуты все критерии настройки, заложенные в программномобеспечении.Для оценки пригодности хроматографической системы используетсяГР3икариина,икаритина,икаризида I,икаризида II,эпимедина А,эпимедина В и эпимедина С с концентрацией 1,0 × 10 -2 мг/мл.Хроматографическая система считается пригодной, если для трехпоследовательных измерений этого ГР выполняются следующие условия:– относительноестандартноеотклонениевремениудерживанияикариина, икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А, эпимедина В иэпимедина С не более 5,0 %;– коэффициент асимметрии пика составляет не более 1,9.Контроль аналитической системы осуществляется перед работой, атакжеприсменехроматографическойколонки,чисткеблокованалитического прибора и т.д.Перед измерением хроматографических параметров исследуемогообразцанеобходимопроанализировать«холостую»пробу(измеритьхроматографические параметры используемого растворителя – метанола (поп.

10.5)),чтобыудостоверитьсявотсутствиипомех,вызванныхзагрязнениями аналитической системы, посуды и реактивов.10.8 Отбор проб и подготовка к анализуДля проведения контроля качества биологически активных добавокотбирают не менее одного блистера (10 капсул) из партии препарата инаносят лабораторную маркировку.165Отобранные пробы допускается хранить в холодильнике (7.2.3) притемпературе от 4 до 6 °С не более 7 суток и не более 30 суток притемпературе не выше минус 20 ºС. При отборе проб составляется Акт отбора.11 Выполнение измеренийВ виалу вместимостью 15,0 мл (7.3.1) вносят содержимое капсулы(флакона) биологически активной добавки. Дозатором механическим сварьируемым объемом дозирования (1,0 - 5,0) мл (7.1.4) в виалу вносят по10,0 мл метанола (7.4.1) и тщательно перемешивают с использованиеморбитального шейкера (7.2.7) в течение 5 мин.

Экстракцию проводят втечение 20 минут, помещая виалы с пробой в УЗВ (7.2.2), после чегоцентрифугируют в течение 10 минут при 4400 об/мин на центрифуге (7.2.6).Верхний надосадочный слой виалы отбирают шприцом (7.2.9) 5 мл,отфильтровывают через фильтровальные насадки на шприц (7.2.8) исобирают в виалу вместимостью 15 мл (7.3.1). Дозатором механическим сварьируемымобъемомдозирования(0,1 - 1,0)мл(7.1.3)ввиалувместимостью 15 мл (7.3.1) вносят 0,1 мл отфильтрованного раствора,дозатором механическим с варьируемым объемом дозирования (1,0 - 5,0) мл(7.1.4) добавляют 9,9 мл метанола (7.4.1) и тщательно перемешивают сиспользованием орбитального шейкера (7.2.7) в течение 5 мин.Полученные растворы анализируют по 0,003 мл при условиях,указанных в п.

10.5.По значению площади хроматографического пика с использованиемградуировочной характеристики и программы обработки данных находятконцентрации икариина, икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А,эпимедина В и эпимедина С в анализируемом растворе.При значении площади хроматографического пика анализируемогокомпонента на хроматограмме исследуемого образца выше верхнегозначения диапазона на градуировочной зависимости для данного компонентанеобходимо разбавление раствора анализируемого образца и повторное166проведение анализа.

При вычислении результатов измерений, то есть расчетесодержания, необходимо учесть степень разбавления раствора введением вформулу 2 (п. 12.1) коэффициента разбавления kр.При значении площади хроматографического пика анализируемогокомпонента на хроматограмме исследуемого образца ниже нижнего значениядиапазона на градуировочной зависимости для данного компонентанеобходимо увеличение исходной навески образца за счет увеличения числакапсул (флаконов) для одного измерения и повторное проведение анализа.Для каждого образца биологически активной добавки проводят дваизмерения.Вычислениесодержанияикариина,икаритина,икаризида I,икаризида II, эпимедина А, эпимедина В и эпимедина С в анализируемомобразце проводят для каждого из двух параллельных определений поформуле (2). За результат измерения принимают среднее арифметическоезначение результатов двух параллельных определений.12 Вычисление результатов измерений12.1 Вычислениеикаризида II,содержанияэпимедина А,икариина,эпимедина Виикаритина,икаризида I,эпимедина Свобразцебиологически активной добавки С, мг в капсуле (флаконе), проводят поформуле(2)где Сгр – концентрация контролируемого соединения, найденная поградуировочной характеристике, мг;К – коэффициент, учитывающий разбавление, равный 1000.Вычисления проводят для каждого из двух параллельных определений,получая, соответственно, значения С1 и С2.12.2 Зарезультатизмеренийсодержанияикариина,икаритина,икаризида I, икаризида II, эпимедина А, эпимедина В и эпимедина С в167образце биологически активной добавки принимают среднее арифметическоезначение результатов двух параллельных определенийC1  C 2,2если выполняется условие приемлемостигдеС1,C(3)С1 - С 2 ≤ rабс,(4)С2 – результатыпараллельныхопределенийсодержанияикариина, икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А, эпимедина В иэпимедина С в образце биологически активной добавки, мг в капсуле(флаконе);rабс – абсолютное значение предела повторяемости, мг в капсуле(флаконе), рассчитывается по формулеrабс = 0,01  r  С ,(5)где С – среднее арифметическое значение двух результатов измерений,мг в капсуле (флаконе);r – относительное значение предела повторяемости, %, приведено втаблице 4.Если условие (4) не выполняется, проводят два повторныхизмерения по п.

10.5.За результат измерений принимают среднее арифметическоезначение результатов четырех определений, если выполняется условиеСmax – Сmin ≤ CR0,95 ,(6)где Сmах, Сmin – максимальное и минимальное значения изполученных четырех результатов параллельных определений концентрацииикариина, икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А, эпимедина В иэпимедина С в образце биологически активной добавки, мг в капсуле(флаконе);CR0,95 – значение критического диапазона для уровня вероятностиР=0,95.168Таблица 4 – Нормативы контроля измерений содержания икариина, икаритина,икаризида I, икаризида II, эпимедина А, эпимедина В и эпимедина С в образцебиологически активной добавки при доверительной вероятности Р=0,95Диапазонизмерений,мг в капсуле(флаконе)Пределповторяемости длядвух результатовпараллельныхопределений,r, %Предел промежуточнойпрецизионности для двухрезультатовизмерений,R, %Нормативконтроля точности(границыотносительнойпогрешностиметодики),К (δ), %0,1 до 50,0включительно172417Значение критического диапазона, CR0,95, для четырех результатоврассчитывается по формулеCR0,95 = 0,013  r  C  ,где C  – среднее(7)арифметическое значение четырех результатовизмерений, мг в капсуле (флаконе), рассчитываемое по формулеC C1  C 2  C3  C 44(8)Если условие (6) не выполняется, выясняют причины превышениякритического диапазона, устраняют их и повторяют выполнение измерений всоответствии с требованиями методики измерений.13 Контроль качества результатов измеренийКонтроль качества результатов измерений при реализации настоящейметодики в лаборатории предусматривает:– контрольповторяемости(воспроизводимости)икаритина,результатовикаризида I,ипромежуточнойизмеренийикаризида II,прецизионностисодержанияэпимедина А,икариина,эпимедина Виэпимедина С в рабочих пробах и в образцах для оценивания (ОО), процедураприготовления которых приведена в приложении А;– оперативный контроль процедуры анализа (контроль точностирезультатов измерений);169– контроль стабильности результатов анализа.13.1 Контроль повторяемостиКонтроль повторяемости проводится в соответствии с разделом 5ГОСТ Р ИСО 5725-6 при каждом анализе рабочей анализируемой пробы илиОО.13.2 Контроль промежуточной прецизионностиКонтроль промежуточной прецизионности проводится по графику иплану контроля качества результатов измерений в лаборатории.