Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения, страница 20

Стандарты национальные.Правила построения, изложения, оформления и обозначения»;ГОСТ Р 8.563-2009 «ГСИ. Методики (методы) измерений»;ГОСТ Р 12.1.019-2009 «Система стандартов безопасности труда.Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты»;145ГОСТ Р ИСО 5725-2002 «Точность (правильность и прецизионность)методов и результатов измерений ч. 1-6»;ГОСТ 12.0.004-90«Системастандартовбезопасноститруда.Организация обучения безопасности труда.

Общие положения»;ГОСТ 12.1.004-91 «Система стандартов безопасности труда. Пожарнаябезопасность. Общие требования»;ГОСТ 12.1.005-88 «Система стандартов безопасности труда. Общиесанитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны»;ГОСТ 12.1.007-76 «Система стандартов безопасности труда. Вредныевещества. Классификация и общие требования безопасности»;ГОСТ 12.4.009-83 «Система стандартов безопасности труда.

Пожарнаятехникадлязащитыобъектов.Основныевиды.Размещениеиобслуживание»;РМГ 60-2003 «ГСИ. Смеси аттестованные. Общие требования кразработке»;РМГ 61-2010«ГСИ.Показателиточности,правильности,прецизионности методик количественного химического анализа. Методыоценки»;РМГ 76-2004 «ГСИ. Внутренний контроль качества результатовколичественного химического анализа».3 Физико-химические свойстваИкариин – брутто-формула C33H40O15, молекулярная моноизотопнаямасса 676,2367 а.е.м. CAS № 489-32-7. Структурная формула146По агрегатному состоянию икариин представляет собой белыйпорошок.Икаритин – брутто-формула C21H20O6, молекулярная моноизотопнаямасса 368,1260 а.е.м.

CAS № 118525-40-9. Структурная формулаПо агрегатному состоянию икаритин представляет собой белыйкристаллический порошок.Икаризид I – брутто-формула C27H30O10, молекулярная моноизотопнаямасса 530,1788 а.е.м. CAS № 56725-99-6. Структурная формулаПо агрегатному состоянию икаризид I представляет собой белыйкристаллический порошок.Икаризид II – брутто-формула C27H30O10, молекулярная моноизотопнаямасса 514,1839 а.е.м.

CAS № 113558-15-9. Структурная формула147По агрегатному состоянию икаризид II представляет собой белыйкристаллический порошок.Эпимедин А – брутто-формула C39H50O20, молекулярная моноизотопнаямасса 838,2895 а.е.м. CAS № 110623-72-8. Структурная формулаПо агрегатному состоянию эпимедин А представляет собой белыйкристаллический порошок.Эпимедин B – брутто-формула C38H48O19, молекулярная моноизотопнаямасса 808,2790 а.е.м.

CAS № 110623-73-9. Структурная формулаПо агрегатному состоянию эпимедин В представляет собой белыйкристаллический порошок.Эпимедин C – брутто-формула C39H50O19, молекулярная моноизотопнаямасса 822,2946 а.е.м. CAS № 110642-44-9. Структурная формула148По агрегатному состоянию эпимедин С представляет собой белыйкристаллический порошок.4 Требования к выполнению аналитических исследованийПри выполнении анализа соблюдают следующие условия:– температура окружающего воздухаот 15 до 28 ºС;– атмосферное давлениеот 84,0 до 106,7 кПа;(от 630 до 800 мм.рт.ст.);– относительная влажность воздухаот 45 до 80 %.Эксплуатацию средств измерений проводят в условиях, приведенных вруководстве по эксплуатации.5 Характеристика погрешности измеренийГраницыотносительнойпогрешностиизмеренийсодержанияикариина, икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А, эпимедина В иэпимедина Свбиологическиактивныхдобавкахметодомвысокоэффективной жидкостной хроматографии с применением тандемногомасс-спектрометрического детектирования при доверительной вероятностиР=0,95 не должны превышать ± 17 %.6 Метод измерений6.1 Измерениявыполняютметодомобращенно-фазовойвысокоэффективной жидкостной хроматографии с применением тандемногомасс-спектрометрическогодетектированияврежимеионизации149электростатическим распылением и регистрации положительно заряженныхионов.Измерение содержания икариина, икаритина, икаризида I, икаризида II,эпимедина А, эпимедина В и эпимедина С в биологически активныхдобавках проводят путем:– экстрагирования икариина, икаритина, икаризида I, икаризида II,эпимедина А, эпимедина В и эпимедина С из содержимого капсулы(флакона) метанолом;– фильтрования полученного экстракта;– разделенияпоследующимэкстрактанахроматографическоймасс-спектрометрическимопределениемколонкесхарактеристикцелевых компонентов в режиме мониторинга селективных реакций (SRM);– регистрации сигнала детектора в цифровой форме с последующейобработкой с использованием ЭВМ.6.2 Для количественного определения содержания икариина, икаритина,икаризида I, икаризида II, эпимедина А, эпимедина В и эпимедина С вбиологически активных добавках методом высокоэффективной жидкостнойхроматографиисприменениемтандемногомасс-спектрометрическогодетектирования используется метод абсолютной калибровки.

Идентификациясоединений осуществляется по соответствию времени удерживания и массспектральнымхарактеристикам,полученнымпоградуировочнымианализируемым растворам.Время анализа одной пробы с учетом пробоподготовки не превышает1,5 ч.7 Средства измерений, вспомогательные устройства и техническиесредства, посуда, реактивы и материалы7.1 Средства измерений7.1.1 Жидкостной хроматограф модели UltiMate 3000RS «Dionex»фирмы«Thermo Scientific»,снасосом,встроеннымдегазатором,150оборудованныйсистемойавтоматическоговводапробы,смасс-спектрометрическим детектором высокого разрешения Q Exactive фирмы«Thermo Scientific» с электрораспылительной ионизацией при атмосферномдавлении (класс точности 1, диапазон измерения 50 - 2000 а.е.м., значенияСКО по времени удерживания и по площади хроматографического пика непревышают 10 % и 5 % соответственно).

Хроматографическая колонкаHYPERSIL Gold aQ длиной 150 мм и внутренним диаметром 2,1 мм, размерсорбента 3 мкм. ЭВМ Dell фирмы «Dell electronics» с программнымобеспечением для сбора и обработки данных XCalibur, версия 2.2.7.1.2 Весы лабораторные электронные XP Analytical модель XP-56 спогрешностью взвешивания ± 0,000001 г и диапазоном взвешивания от0,00001 до 52,0 г, производства компании «Mettler Toledo», Швейцария.7.1.3 Дозатор механический с варьируемым объемом дозирования(0,1 - 1,0) мл, предел точности ± (2,0…0,6) %, ООО «Biohit», Финляндия,кат. № 720060.7.1.4 Дозатор механический с варьируемым объемом дозирования(1,0 - 5,0) мл, предел точности ± (2,0…0,5) %, ООО «Biohit», Финляндия,кат.

№ 720110.7.1.5 Цилиндр 1-50-1 ГОСТ 1770-74.7.1.6 Цилиндр 1-1000-1 ГОСТ 1770-74.7.1.7 Дозатор механический с варьируемым объемом дозирования(0,01 - 0,10) мл, предел точности  (3,0…0,8) % производства компании«Sartorius Biohit Liquid Handing», Финляндия, кат. № 720050.7.2 Вспомогательные устройства7.2.1 Шкаф сушильный типа SNOL 67/350, диапазон автоматическогорегулирования температур (50-350) °С, ООО «СНОЛ-ТЕРМ».7.2.2 Ванна ультразвуковая «Серьга» УЗМ 001 ТУ СУР 3.836.007,Россия.1517.2.3 Холодильник бытовой с морозильной камерой по ГОСТ 16317-87,Россия.7.2.4 Аквадистиллятор электрический, тип ДЭ-4-2М, ТУ 64-1-721-79,Россия.7.2.5 Установка для получения деионизованной воды NANOPureфирмы «Thermo Scientific», США.7.2.6 Центрифуга низкоскоростная Eppendorf 5702, обеспечивающаямаксимальнуюскоростьвращениядо4400 об/мин,Германия,кат.

№ 5702 000.019.7.2.7 Орбитальный шейкер MS 3 basic, с максимальной скоростьювращения 3000 об/мин производства фирмы «IKA», Германия, кат. №3617000.7.2.8 Фильтровальные насадки на шприц Spartan диаметром 30 мм сразмером пор 0,20 мкм производства фирмы «Whatman», кат. № 9.049 941.7.2.9 Шприц Spartan вместимостью 10 мл производства фирмы«Whatman», кат. № REF 309604.7.2.10 Упариватель-концентратор на 6 портов производства фирмы«Supelco», кат. № 22971, США.7.3 Посуда7.3.1 Виалы стеклянные с герметично завинчивающимися крышкамивместимостью 15 мл1 фирмы «Supelсo», США, кат.

№ 27161.7.3.2 Виалы стеклянные с герметично завинчивающимися крышкамивместимостью 2 мл фирмы «Supelсo», США, кат. № 27029-U.7.3.3 Шпатель металлический из нержавеющей стали 150х5 мм, HeinzHerenz Medizinalbedarf GmbH, Германия, кат. № 1110221.7.3.4 Стаканчик для взвешивания СВ-19/9 ГОСТ 1770-74.1В соответствии с международной системой единиц (СИ)3внесистемная единица «литр» (л)допускается к применению наравне с кубическим дециметром (дм ), а также кратные и дольные от неёединицы объёма - «миллилитр» (мл), «микролитр» (мкл) и т.п.1527.3.5 Бутыльвместимостью1000 млфирмы«Kavalier»,Чехия,кат. № 2070/М.7.4 Реактивы и материалы7.4.1 Метиловый спирт (метанол) для ВЭЖХ производства компании«Merck», Германия, кат. № 1.06018.2500.7.4.2 Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.7.4.3 Азот газообразный, осч, марки А, ТУ 51-940-80.7.4.4 Икариин – стандартный образец с содержанием основноговещества не менее 95,0 %, производства компании «PhytoLab», кат.

№ 89714.7.4.5 Икаритин – стандартный образец с содержанием основноговещества не менее 95,0 %, производства компании «PhytoLab», кат. № 80478.7.4.6 Икаризид I – стандартный образец с содержанием основноговещества не менее 95,0 %, производства компании «PhytoLab», кат. № 83316.7.4.7 Икаризид II – стандартный образец с содержанием основноговещества не менее 95,0 %, производства компании «PhytoLab», кат. № 83286.7.4.8 Эпимедин А – стандартный образец с содержанием основноговещества не менее 95,0 %, производства компании «PhytoLab», кат. № 80586.7.4.9 Эпимедин B – стандартный образец с содержанием основноговещества не менее 95,0 %, производства компании «PhytoLab», кат.

№ 80587.7.4.10 Эпимедин C – стандартный образец с содержанием основноговещества не менее 95,0 %, производства компании «PhytoLab», кат. № 80588.7.4.11 Калий двухромовокислый, ч., ГОСТ 4220-75.7.4.12 Кислотасернаяконцентрированная(ρ=1,84кг/л),х.ч.,ГОСТ 4204-77.7.4.13 Картриджи для твердофазной экстракции HLB вместимостью 6мл с массой сорбента 200 мг производства компании «Supelco», США,кат.

№ 54183-U.7.4.14 Ацетонитрил для градиентной ВЭЖХ производства компании«Panreac», США, кат. № 221881.1611.1537.4.15 Муравьиная кислота «для ВЭЖХ» 98 %, производства компании«Fluka», кат. № 56302-1L.7.4.16 Вода деионизованная, ГОСТ Р 52501-2005.Примечания1 Средства измерений должны быть внесены в Госреестр СИ РФ иповерены в установленные сроки, иметь клеймо и/или свидетельство оповерке.2 Реактивы и материалы должны иметь паспорта или сертификаты,подтверждающие их пригодность.3 Допускаетсявспомогательныхприменениеустройств,другихпосуды,средствреактивовиизмерений,материаловсметрологическими и техническими характеристиками не хуже, чем уприведенных в разделе 6.8 Требования к квалификации операторовК выполнению работ допускают лиц, имеющих квалификацию химикааналитика или техника-аналитика, прошедших производственное обучение,проверку знаний и практический опыт работы в химических лабораториях среактивами и лекарственными препаратами и не имеющих медицинскихпротивопоказаний.9 Требования безопасности и охраны окружающей среды9.1 При выполнении измерений соблюдают требования техникибезопасностиприпроведенииработсвреднымивеществамипоГОСТ 12.1.007-76.9.2 Требования техники безопасности при работе с электроустановкамипо ГОСТ 12.1.019-2009.9.3 Требованияорганизациибезопасности по ГОСТ 12.0.004-2009.обученияработающихтехнике1549.4 Помещения для выполнения измерений должны быть оборудованыприточно-вытяжной вентиляцией, обеспечивающей требуемую кратностьобмена воздуха на рабочих местах.

Содержание вредных веществ в воздухерабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005-88.9.5 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиямпожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и быть оборудованнымсредствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.9.6 Нормирование по оценке световой среды осуществляется поотраслевомубазовомудокументуСНиП23-05-95«Естественноеиискусственное освещение».9.7 При установке, монтаже и эксплуатации хроматографическойсистемы следует соблюдать ПБ 03-576-03 «Правила устройства и безопаснойэксплуатации сосудов, работающих под давлением».9.8 Исполнители должны быть проинструктированы по лабораторнойинструкции о мерах техники безопасности и допущены к проведению работ.9.9 Производственные отходы и градуировочные растворы собираютсяв специальные емкости и уничтожаются установленным порядком.10 Подготовка к выполнению измерений10.1 Осушка и очистка газовДля очистки газов, используемых при анализе, применяют фильтры,рекомендованные руководством по эксплуатации масс-спектрометра.10.2 Подготовка посудыПосуда, используемая для приготовления растворов и аналитическихизмерений, замачивается на (3-4) часа в свежеприготовленном 3 %-номрастворе двухромовокислого калия (7.4.11) в серной кислоте (7.4.12) (5 гдвухромовокислого калия на 100 мл концентрированной серной кислоты).Далее отмывается в проточной воде с последующим многократнымополаскиванием дистиллированной водой (7.4.2), полученной при помощи155аквадистиллятора (7.2.4).