Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения, страница 21

После высушивания в сушильном шкафу (7.2.1)при температуре 150 С посуду следует хранить герметично закрытой бездоступа влаги.10.3 Приготовление растворов и буферовЛюбые растворы и субстанции перед взвешиванием или разбавлениемнеобходимо довести до комнатной температуры.После приготовления растворов на бутыли наклеивают этикетки снаименованием раствора, концентрацией и датой приготовления.10.3.1 Приготовление подвижной фазыДляпроведенияхроматографическогоанализаиспользуетсядвухкомпонентная подвижная жидкая фаза:– компонент А – 0,1 %раствормуравьинойкислотывсмесидеионизованной воды с ацетонитрилом марки «для ВЭЖХ» в соотношениикомпонентов 95:5 (объем.);– компонент В – 0,1 % раствор муравьиной кислоты в ацетонитрилемарки «для ВЭЖХ».Для приготовления 0,1 % раствора муравьиной кислоты в смесидеионизованной воды с ацетонитрилом (в соотношении компонентов 95:5объем.) в мерный цилиндр емкостью 1000 мл (7.1.6) вносят 500 млдеионизованнойводы(7.4.16).Далеедозатороммеханическимсварьируемым объемом дозирования (1,0 - 5,0) мл (7.1.4) вносят 1,0 млмуравьиной кислоты (7.4.15) и, с использованием мерного цилиндра объемом50,0 мл (7.1.5), вносят 50,0 мл ацетонитрила марки «для градиентной ВЭЖХ»(7.4.14) и доводят до метки 1000 мл деионизованной водой (7.4.16).Приготовленный раствор переливают в бутыль вместимостью 1000 мл (7.3.5),плотно закрывают крышкой и тщательно перемешивают.Для приготовления 0,1 % раствора муравьиной кислоты в ацетонитрилев бутыль вместимостью 1000 мл (7.3.5) мерным цилиндром вместимостью1561000 мл (7.1.6) вносят 700 мл ацетонитрила марки «для градиентной ВЭЖХ»(7.4.14).Далеедозатороммеханическимсварьируемымобъемомдозирования (1,0-5,0) мл (7.1.4) вносят 1,0 мл муравьиной кислоты (7.4.15), и,с использованием мерного цилиндра вместимостью 1000 мл (7.1.6), вносят300,0 мл ацетонитрила марки «для градиентной ВЭЖХ» (7.4.14), растворплотно закрывают крышкой и тщательно перемешивают.Срок хранения приготовленных растворов при температуре (25 ± 2) Сне более семи дней.10.3.2 Приготовлениеаттестованнойсмеси(АС)икариина,икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А, эпимедина В иэпимедина С в метиловом спирте с концентрацией 0,1 мг/млВ виале вместимостью 15 мл (7.3.1) на аналитических весах (7.1.2)взвешивают(10,0 ± 0,1) мгстандартногообразцаикариина(7.4.4 ).Количество метилового спирта V, мл, которое необходимо добавить дляприготовления исходного раствора стандартного образца с концентрацией1 мг/мл, вычисляется по формулеVm с 100 ,(1)где μ – массовая доля вещества в стандартном образце, %, указанная впаспорте на образец;m – навеска стандартного образца, мг;с – массоваяконцентрацияикариинависходномрастворе(с=1,0 мг/мл).Расчетное количество метилового спирта (7.4.1) отбирают дозатороммеханическим с варьируемым объемом дозирования (1,0 - 5,0) мл (7.1.4).

Ввиалу с навеской добавляют требуемое количество метилового спирта (7.4.1),закрывают крышкой и тщательно перемешивают на орбитальном шейкере(7.2.7) в течение 1 минуты.157Аналогичным способом готовят исходные растворы стандартныхобразцовикаритинаикаризида I(7.4.5),(7.4.6),икаризида II(7.4.7),эпимедина А (7.4.8), эпимедина В (7.4.9) и эпимедина С (7.4.10) в метиловомспирте (7.4.1) с концентрациями 1,0 мг/мл.В виалу вместимостью 15 мл (7.3.1) дозатором механическим сварьируемым объемом дозирования (0,1-1,0) мл (7.1.3) вносят по 1,0 млисходныхрастворовэпимедина А,икариина,эпимедина Виикаритина,эпимедина Сикаризида I,викаризида II,метиловомспиртесконцентрацией 1,0 мг/мл и 3 мл метанола (7.4.1), закрывают крышкой,тщательно перемешивают и обрабатывают в ультразвуковой ванне (УЗВ)(7.2.27.2.2) в течение 5 мин.Срок хранения АС в метиловом спирте при температуре (5,0 ± 1,0) ºС –не более 72 часов.10.3.3 Приготовление градуировочных растворов (ГР) икариина,икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А, эпимедина В иэпимедина С в метиловом спиртеИз АС икариина, икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А,эпимедина В и эпимедина С с концентрацией 1,0 мг/мл путем смешивания икратного разбавления метиловым спиртом готовят семь ГР, концентрации иалгоритм приготовления которых указаны в таблицах 1 и 2.ГР готовят в тот же день, что и АС.Таблица 1 – Концентрации ГР икариина, икаритина, икаризида I,эпимедина А, эпимедина В и эпимедина С в метиловом спиртеПриготавливаемыйраствор№№КонцентрацияГРкомпонента,мгмл15,0×10-222,5×10-231,0×10-245,0×10-351,0×10-3Раствор АС или ГР, используемыйдля разведенияКонцентрацияОбъём,компонента,млмгмл0,15,00,12,50,11,00,10,5-21,0×101,0икаризида II,Метиловый спиртОбъём,мл5,07,59,09,59,0158Приготавливаемыйраствор65,0×10-471,0×10-4Раствор АС или ГР, используемыйдля разведения5,0×10-31,01,0×10-31,0Метиловый спирт9,09,0Таблица 2 – Алгоритм приготовления ГР икариина, икаритина, икаризида I, икаризида II,эпимедина А, эпимедина В и эпимедина С в метиловом спирте№№ГРКонцентрация ГР,мг/млАбсолютнаяпогрешностьаттестованногозначения ГР,мг/млАС0,14,02×10-3ГР15,0×10-22,04×10-3ГР22,5×10-21,13×10-3ГР31,0×10-24,19×10-4Методика приготовленияАСикариина,икаритина,икаризида I,икаризида II, эпимедина А, эпимедина В иэпимедина С готовятся в соответствии с п.

10.3.2Дозатором механическим с варьируемымобъемом дозирования (1,0-5,0) мл (7.1.4)отбирают 5,0 мл АС икариина, икаритина,икаризида I,икаризида II,эпимедина А,эпимедина В и эпимедина С и помещают ввиалу вместимостью 15 мл (7.3.1). Дозатороммеханическимсварьируемымобъемомдозирования (1,0-5,0) мл (7.1.4) добавляют 5,0мл метилового спирта (7.4.1). Виалу закрываюткрышкой и раствор тщательно перемешивают сиспользованием орбитального шейкера (7.2.7)при 3000 об/мин в течение 2 мин и в течение 5мин обрабатывают в УЗВ (7.2.2).Дозатором механическим с варьируемымобъемом дозирования (1,0-5,0) мл (7.1.4)отбирают 2,5 мл АС икариина, икаритина,икаризида I,икаризида II,эпимедина А,эпимедина В и эпимедина С с концентрацией0,1 мг/мл. и помещают в виалу вместимостью 15мл (7.3.1).

Дозатором механическим сварьируемым объемом дозирования (1,0-5,0) мл(7.1.4) добавляют 7,5 мл метилового спирта(7.4.1). Виалу закрывают крышкой и раствортщательно перемешивают с использованиеморбитального шейкера (7.2.7) при 3000 об/мин втечение 2 мин и в течение 5 мин обрабатывают вУЗВ (7.2.2)Дозатором механическим с варьируемымобъемом дозирования (0,1-1,0) мл (7.1.3)отбирают 1,0 мл АС икариина, икаритина,икаризида I,икаризида II,эпимедина А,эпимедина В и эпимедина С с концентрацией0,1 мг/мл. и помещают в виалу вместимостью 15мл (7.3.1).

Дозатором механическим сварьируемым объемом дозирования (1,0-5,0) мл(7.1.4) добавляют 9,0 мл метилового спирта159Концентра№№ция ГР,ГРмг/млАбсолютнаяпогрешностьаттестованногозначения ГР,мг/млГР45,0×10-32,17×10-4ГР51,0×10-34,35×10-5ГР65,0×10-42,25×10-5Методика приготовления(7.4.1). Виалу закрывают крышкой и раствортщательно перемешивают с использованиеморбитального шейкера (7.2.7) при 3000 об/мин втечение 2 мин и в течение 5 мин обрабатывают вУЗВ (7.2.2)Дозатором механическим с варьируемымобъемом дозирования (0,1-1,0) мл (7.1.3)отбирают 0,5 мл АС икариина, икаритина,икаризида I,икаризида II,эпимедина А,эпимедина В и эпимедина С с концентрацией0,1 мг/мл и помещают в виалу вместимостью 15мл (7.3.1).

Дозатором механическим сварьируемым объемом дозирования (1,0-5,0) мл(7.1.4) добавляют 9,5 мл метилового спирта(7.4.1). Виалу закрывают крышкой и раствортщательно перемешивают с использованиеморбитального шейкера (7.2.7) при 3000 об/мин втечение 2 мин и в течение 5 мин обрабатывают вУЗВ (7.2.2)Дозатором механическим с варьируемымобъемом дозирования (0,1-1,0) мл (7.1.3)отбирают 1,0 мл ГР3 икариина, икаритина,икаризида I,икаризида II,эпимедина А,эпимедина В и эпимедина С с концентрацией1,0×10-2 мг/мл.ипомещаютввиалувместимостью 15 мл (7.3.1). Дозатороммеханическимсварьируемымобъемомдозирования (1,0-5,0) мл (7.1.4) добавляют9,0 мл метилового спирта (7.4.1). Виалузакрывают крышкой и раствор тщательноперемешивают с использованием орбитальногошейкера (7.2.7) при 3000 об/мин в течение 2 мини в течение 5 мин обрабатывают в УЗВ (7.2.2)Дозатором механическим с варьируемымобъемом дозирования (0,1-1,0) мл (7.1.3)отбирают 1,0 мл ГР4 икариина, икаритина,икаризида I,икаризида II,эпимедина А,эпимедина В и эпимедина С с концентрацией5,0×10-3 мг/мл.ипомещаютввиалувместимостью 15 мл (7.3.1).

Дозатороммеханическимсварьируемымобъемомдозирования (1,0-5,0) мл (7.1.4) добавляют9,0 мл метилового спирта (7.4.1). Виалузакрывают крышкой и раствор тщательноперемешивают с использованием орбитальногошейкера (7.2.7) при 3000 об/мин в течение 2 мини в течение 5 мин обрабатывают в УЗВ (7.2.2).160Концентра№№ция ГР,ГРмг/млГР71,0×10-4Абсолютнаяпогрешностьаттестованногозначения ГР,мг/млМетодика приготовления4,45×10-6Дозатором механическим с варьируемымобъемом дозирования (0,1-1,0) мл (7.1.3)отбирают 1,0 мл ГР5 икариина, икаритина,икаризида I,икаризида II,эпимедина А,эпимедина В и эпимедина С с концентрацией1,0×10-3 мг/мл.ипомещаютввиалувместимостью 15 мл (7.3.1). Дозатороммеханическимсварьируемымобъемомдозирования (1,0-5,0) мл (7.1.4) добавляют9,0 мл метилового спирта (7.4.1).

Виалузакрывают крышкой и раствор тщательноперемешивают с использованием орбитальногошейкера (7.2.7) при 3000 об/мин в течение 2 мини в течение 5 мин обрабатывают в УЗВ (7.2.2)Срок хранения ГР при температуре (5,0±1,0) ºС – 3 суток.10.4 Подготовка хроматографической колонкиХроматографическуюколонкуустанавливаютвтермостатхроматографа, подсоединяют к системе и промывают подвижной фазой поприведеннойнижепрограмме.Объемныйрасходподвижнойфазыустанавливают 0,5 мл/мин. Температуру термостата устанавливают 30 С.Изменение соотношения компонентов подвижной фазы осуществляютступенчато: 90 % компонента B – промывают систему в течение 30 минут,50 % компонента B – промывают систему в течение 30 минут и 20 %компонента B – промывают систему в течение 1 часа.После окончания промывки системы устанавливают рабочие условия20 % компонента B.10.5 Условияхроматографическогоразделенияимасс-селективного детектирования10.5.1 Условия хроматографического разделенияПодвижная фаза– компонент А – 0,1 % раствор муравьиной кислоты161в смеси деионизованная вода/ацетонитрил марки«для ВЭЖХ» (95 % об/5 % об);– компонент В – 0,1 % раствор муравьиной кислотыв ацетонитриле марки «для ВЭЖХ».Режимхроматографического элюированияГрадиентныйВремя, мин0,01,04,04,57,510,511,0ТемператураСоотношение компонентовподвижной фазыА, %В, %80208020752560405955958020Скоростьпотока,мл/мин0,60,60,60,60,60,60,645 Стермостата колонкиОбъем ввода пробы0,003 млВремя анализа15 мин10.5.2 Условия работы масс-спектрометрического детектораМасс-спектрометрическийдетектормасс-спектрометр высокого разрешенияQExactive с источником ионизацииHESI-IIРежим источника ионизацииИонизацияэлектростатическимраспылениемприатмосферномдавленииРежим детектированияДетектирование в режиме мониторингаселективных реакций (SRM) приположительной ионизации (параметрыдетектированияпредставленывтаблице 3)Скорость потока газа-осушителя5 ед.Скорость потока вспомогательного 10 ед.газа162Скорость потока газа нараспылителеНапряжение на капилляреТемпература на распылителеТемпература капилляра40 ед.4,0 кВ280 С270 СДля идентификации икариина, икаритина, икаризида I, икаризида II,эпимедина А, эпимедина В и эпимедина С в биологически активных добавкахвтаблице3приведеныосновныехарактеристикирегистрируемыхсоединений.Таблица 3 – Время удерживания, используемые при регистрации соединений SRMпереходы и их относительные интенсивности№п/пНазваниесоединенияВремяудерживания,мин1.Икариин4,42.Икаритин7,03.Икаризид I5,84.Икаризид II6,05.Эпимедин А3,76.Эпимедин В3,97.Эпимедин С4,2Основной SRMпереход (энергиясоударительнойдиссоциации)677,2440→313,0707(40 В)369,1333→313,0703(50 В)531,1861→313,0703(40 В)515,1912→313,0703(40 В)839,2968→369,1330(30 В)809,2863→369,1330(30 В)823,3019→369,1330(30 В)ОтносительнаяинтенсивностьподтверждающегоSRM перехода, %ПодтверждающийSRM переход677,2440→369,133325-45369,1333→243,065210-20531,1861→369,133050-60515,1912→369,133050-60839,2968→313,070310-20809,2863→313,070310-20823,3019→313,070310-2010.6 Установление градуировочной характеристикиДля установления градуировочных характеристик градуировочныерастворыГР1-ГР10эпимедина А,икариина,эпимедина Виикаритина,икаризида I,эпимедина С(таблицаикаризида II,2)дозатороммеханическим с варьируемым объемом дозирования (0,1-1,0) мл (7.1.3)отбирают по 0,5 мл ГР1-ГР10 и помещают в виалы вместимостью 2 мл(7.3.2).