Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения
Описание файла
PDF-файл из архива "Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения", который расположен в категории "". Всё это находится в предмете "химия" из Аспирантура и докторантура, которые можно найти в файловом архиве МГУ им. Ломоносова. Не смотря на прямую связь этого архива с МГУ им. Ломоносова, его также можно найти и в других разделах. , а ещё этот архив представляет собой кандидатскую диссертацию, поэтому ещё представлен в разделе всех диссертаций на соискание учёной степени кандидата химических наук.
Просмотр PDF-файла онлайн
Текст из PDF
Московский государственный университет имени М.В. ЛомоносоваХимический факультетКафедра аналитической химииНа правах рукописиШЕВЛЯКОВА ОЛЕСЯ АЛЕКСАНДРОВНАОпределение флавоноидов горянки и их метаболитов методомтандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения02.00.02 – Аналитическая химияДиссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукНаучный руководитель:к.х.н., с.н.с., Родин И.А.Москва – 20162ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 6Глава 1 Обзор литературы .................................................................................... 121.1 Состав смеси флавоноидов горянки .............................................................. 121.2 Методы извлечения флавоноидов из горянки ..............................................
141.3 Выделение отдельных биоактивных компонентов горянки ....................... 161.4 Методы определения целевых аналитов....................................................... 191.4.1 Тонкослойная хроматография .................................................................... 191.4.2 Капиллярный электрофорез ........................................................................
201.4.3 Газовая хроматография................................................................................ 251.4.4 Высокоэффективная жидкостная хроматография .................................... 261.5 Определение флавоноидов горянки в биопробах ........................................ 321.6 Исследования метаболизма флавоноидов горянки ..................................... 34Глава 2 Материалы и методы исследования ......................................................
442.1 Реактивы и материалы .................................................................................... 442.2 Стандартные образцы ..................................................................................... 452.3 Исследуемые образцы..................................................................................... 452.4 Оборудование, вспомогательные устройства, средства измерений ипрограммное обеспечение .................................................................................... 462.6 Приготовление рабочих и буферных растворов ..........................................
482.6.1 Подготовка посуды ...................................................................................... 482.6.2 Подготовка деионизованной воды ............................................................. 492.6.3 Приготовление фосфатного буферного раствора ..................................... 492.6.4 Приготовление карбонатного буферного раствора ..................................
492.6.5 Приготовление растворов стандартных образцов .................................... 492.6.6 Приготовление градуировочных растворов икариина, икаритина,икаризида I, икаризида II, эпимедина А и эпимедина В в метиловомспирте ..................................................................................................................... 502.6.7 Приготовлениеподвижнойфазыдлявысокоэффективнойжидкостной хроматографии ................................................................................. 5032.7 Техника эксперимента ....................................................................................
512.7.1 Схемаэкспериментапоисследованиюпроцессовмасс-фрагментации и оптимизации энергии соударений .......................................... 512.7.2 Схема эксперимента по определению флавоноидов горянкиврастительных материалах и продуктах на их основе ........................................ 532.7.3 Схема эксперимента по разработке способа извлечения основныхкомпонентов горянки из растительных материалов сверхкритическимдиоксидом углерода .............................................................................................. 552.7.4 Схемаэкспериментапоразработкеспособаопределения действующих соединений горянки в биологических пробах .... 562.7.5 Схемаэкспериментапоразработкеспособаобнаруженияфлавоноидов горянки в растительном сырье и продуктах на его основе .......
572.7.6 Получение биоматериала ............................................................................ 58Глава 3. Результаты и обсуждение ...................................................................... 603.1 Разработка способа определения флавоноидов горянки методомВЭЖХ-МС/МС ...................................................................................................... 603.1.1 Разработка способа идентификации икариина ......................................... 603.1.2 Разработкаспособаколичественногоопределенияфлавоноидов горянки в режиме регистрации выбранных ионныхпереходов ............................................................................................................... 663.2 Разработка способа группового обнаружения флавоноидов горянки .......
773.3 Разработка способа экстракции флавоноидов из горянки .......................... 863.4 Разработка способа определения флавоноидов горянки в моче ................ 893.5 Обнаружение метаболитов флавоноидов горянки в моче крыс............... 100ВЫВОДЫ ............................................................................................................. 106СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ......................................... 108ПРИЛОЖЕНИЕ А.
.............................................................................................. 133ПРИЛОЖЕНИЕ Б ................................................................................................ 1434СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙCID (ДАС)– collisioninduceddissociation(диссоциация,активированная соударениями)SRM (МВР)– selectedreactionmonitoring(мониторингзаданных(выбранных) реакций)HCD (ДАСПЭ)– higher-energyC-trapdissociation(диссоциация,активированная соударениями при повышенной энергии)АС– аттестованная смесьБАВ– биологически активные веществаБСТФА– бис(триметилсилил)-N,O-трифторацетамидВЭЖХ– высокоэффективная жидкостная хроматографияВЭТСХ– высокоэффективная тонкослойная хроматографияГР– градуировочный растворГХ– газовая хроматографияДМД– диодно-матричный детекторЖЖЭ– жидкостно-жидкостная экстракцияИК– инфракрасная спектроскопияИЭР– ионизация электрораспылениемКЗЭ– капиллярный зонный электрофорезКЭ– капиллярный электрофорезКЭХ– капиллярная электрохроматографиям.д.– миллионные долиМС– масс-спектрометрияМС/МС– тандемная масс-спектрометрияМСТФА– N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамидСК-СО2– экстракция сверхкритическим диоксидом углеродаСО– стандартный образецТМС– триметилсилильныйТСХ– тонкослойная хроматографияТФЭ– сорбционное концентрирование5УЗВУФ– ультразвуковая ванна– ультрафиолетовыйдетектор(ультрафиолетовоедетектирование)ХИАД– химическая ионизация при атмосферном давленииЯМР– ядерный магнитный резонанс6ВВЕДЕНИЕАктуальность проблемы.Наиболее древнее и актуальное направление фармацевтической химиисвязано с созданием лекарственных средств и биологически активныхдобавок к пище на основе растительного сырья, в состав которого входятсотни или даже тысячи различных соединений.
Терапевтический эффект, какправило, обусловлен синергизмом нескольких компонентов.Исследование качественного и количественного состава компонентоврастительного сырья и препаратов на его основе проводится как при поискеновых биологически активных соединений и реализуемых с их помощьюфармакологических эффектов, так и при контроле качества сырья и готовыхлекарственных форм известных препаратов. Государственной ФармакопеейРФ регулируется лишь групповое определение флавоноидов методамититриметрии и спектрофотометрии, в то время как ввиду различающихсябиологических эффектов разных представителей этого ряда необходима ихиндивидуальнаяидентификацияврастительномсырье.Согласнофедеральному закону №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» прирегистрацииновыхметаболизмаипрепаратовнеобходимофармакокинетикипроводитьактивныхисследованиефармакологическихингредиентов.Открытиеновыхфармакологическихэффектовфлавоноидовинициировало более пристальное внимание исследователей к растениям родаEpimedium, широко используемым в рамках традиционной медицины вКитае, Корее и на Дальнем Востоке.
В последние годы опубликованобольшоеколичестворабот,посвященныхисследованиюсоставафлавоноидов, характерных для некоторых представителей этого рода. Приэтом состав флавоноидов горянки исчерпывающим образом изучен не был.Основными действующими веществами горянки являются флавоноиды:икариин, икаритин, икаризиды I, II, эпимедины A, В, C, обладающие7широкимспектромандрогенной,биологическойактивности:антидепрессантной,иммуномодулирующей[1-3].противоопухолевой,антиостеопорознойИспользованиеивысокоэффективнойжидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с тандемным массспектрометрическим детектированием высокого разрешения обеспечиваетнадежную идентификацию не только действующих веществ горянки, но и ихметаболитов, благодаря высокоселективному разделению исследуемыхсмесейиинформативнымспектрам.Ограниченностьдоступнойизлитературы информации о составе флавоноидов растений рода Epimedium иих масс-спектрометрических характеристиках не позволяла установитьобщиезакономерностинеобходимостьихфрагментации.углубленногоТакимобразом,возниклахроматомасс-спектрометрическогоисследования комплекса биоактивных соединений горянки.
Значительнаявариабельность состава экстрактивных компонентов в различных образцахрастительного сырья обусловливает необходимость разработки селективного,чувствительного и экспрессного способа определения активных компонентовгорянки в растительном сырье и их метаболитов в биологических образцах.Цели и задачи исследования.Цель работы состояла в разработке способа определения биологическиактивных веществ растений рода Epimedium методом высокоэффективнойжидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометриейвысокого разрешения и апробация разработанного подхода при обнаруженииметаболитов флавоноидов горянки с использованием полученной изэкспериментальных данных информации о путях фрагментации исследуемойгруппы веществ.Достижение поставленной цели предусматривало решение следующихзадач:– изучение процессов ионизации и путей фрагментации исследуемойгруппы веществ в условиях ВЭЖХ в сочетании с тандемной масс-8спектрометрией высокого разрешения, оптимизация условий получениямасс-спектров;– обоснованиережимаэкстрагированияфлавоноидовгорянкисверхкритическим диоксидом углерода;– выборусловийхроматографическогоразделенияисследуемойгруппы веществ;– разработка алгоритма обнаружения флавоноидов горянки на основезакономерностей фрагментации;– выбор условий подготовки биологических проб, обеспечивающихэффективное извлечение определяемых соединений, изучение влиянияматрицы на степень ионизации;– обнаружение метаболитов биологически активных веществ горянки вмоче лабораторных животных.Научная новизна.1.