Диссертация (Взаимодействие эритроцитов в средах, индуцирующих их агрегацию - исследование с помощью лазерных пинцетов), страница 3

Измеряется M – как интенсивность через 10секунд после снятия сдвиговой скорости и M1 – как интенсивность через 10 секунд после уменьшениясдвиговой скорости до 3 с-1.161.2.1 Фактор среды в агрегации эритроцитов: макромолекулы какпроагреганты и ингибиторы агрегацииАЭ сильно зависит от типа и концентрации белков плазмы крови в окружающейих среде.

Сейчас известно порядка 10 белков, играющих роль в АЭ. Это такие белки,как фибриноген [44-49], γ-глобулин [45-47,50], с-реактивный белок [51], гаптоглобин[51], альбумин [46-48] и другие [52], среди которых основную роль играет фибриноген.В таблице 1.1 показана роль белков в АЭ, изученная разными авторами. Для некоторыхбелков, таких как альбумин, имеющиеся данные о роли в агрегации не согласуются.Причину различий адресуют к комплексному участию белков в агрегации эритроцитови различием в использованных методах [5].Таблица 1.1. Роль различных белков плазмы крови в агрегации эритроцитов.

Стрелки вверх ивниз обозначают увеличение и уменьшение агрегации эритроцитов, соответственно [5].Белок плазмы кровиМолекулярнаямасса (kDa)Концентрация в плазме(мг/мл)Эффект на агрегациюэритроцитовФибриноген3401,5-3,0↑γ-глобулин1508↑, нет эффектаМ-глобулин9001,5↑С-реактивный белок25<0,01↑Трансферрин802,0-3,6нет эффектаГаптоглобин380,5-2,5↑, нет эффектаЦерулоплазмен1510,2-0,4нет эффектаАльфа1-кислотныйгликопротеин400,5-1,0↑, нет эффектаАльбумин6620-50↑,↓,нет эффекта17АЭможетпроисходитьиврастворахнейтральныхсинтетическихмакромолекул [53]. Растворы нейтральных макромолекул широко используются дляизучениямеханизмовэритроцитоввзаимодействияиндуцированноеэритроцитовнейтральными[54-56].макромолекуламиВзаимодействиеявляетсяболеепростым по сравнению с взаимодействием в плазме, которая является электролитом.Степень выраженности индуцирующей или ингибирующей роли макромолекул в АЭможно выстроить по гидродинамическому радиусу (Rh) макромолекул, как показано нарисунке 1.4 [57].

Макромолекулы с Rh < 4 нм ингибируют АЭ, а с Rh > 4 нм являютсяпроагрегантами. Белки плазмы крови могут быть выстроены аналогичным образом. Нотакой подход имеет недостаток в связи с тем, что он не учитывает наблюдаемыйсинергетический эффект макромолекул в АЭ, как показано на примере несколькихмакромолекул на рисунке 1.5.Рис.

1.4. Роль нейтральных макромолекул в агрегации эритроцитов в зависимости отгидродинамического радиуса (Rh). Измерения проведены с помощью агрегометра Myrenne.Разные символы в графике означают тип макромолекул, □ – POE (полиэтилен), ∆ - декстран, ○– PVP (поливинилпиролидон), концентрация макромолекул 3%. Наблюдается переход ролимакромолекул из ингибитора к проагреганту при Rh = 4 нм [57].18Синергетический эффект в АЭ наблюдается как для белков, так и дляейтральных макромолекул [45,55]. Макромолекулы, которые являются в отдельностипроагрегантами и ингибиторами, в совокупности могут как усиливать, так и ослаблятьАЭ.

В этом и заключается одно из объяснений отличия результатов полученныхразнымиавторами,представленноевтаблице2.Темнеменеепричинысинергетического эффекта до конца еще не установлены и остаются малоизученными.Рис. 1.5. Синергетический эффект макромолекул в агрегации эритроцитов. (а) для белковальбумина, фибриногена и γ-глобулина, – наблюдается значительное увеличение параметра,характеризующего степень АЭ при наличии всех трех белков. (б) для нейтральныхмакромолекул декстрана и PEG (полиэтиленгликоль), наблюдается усиление (при наличииPEG 35 кДа и PEG 10 кДа) и ослабление (при наличии декстрана 73 кДа + PEG 10 кДа) АЭ.При этом PEG 35 кДа и PEG 10 кДа по отдельности не индуцируют АЭ, а декстран 73 кДаиндуцирует АЭ.

[45,55]1.2.2Факторклеткивагрегацииэритроцитов:«агрегируемость»эритроцитовАЭ также определяется «агрегируемостью» эритроцитов – склонностью самихклеток к формированию агрегатов [58]. Эритроциты одного донора могут агрегировать19сильнее, чем у другого в той же самой среде. [42,43,59,60]. Агрегируемостьэритроцитов определяется внутренними свойствами клетки и измеряется в заданномрастворенейтральныхмакромолекулымакромолекул.декстрана.ИзменениеПриэтомчащеагрегируемостивсегоиспользуютсяэритроцитовпозволяетразделить вклады свойств среды и клетки в АЭ.

«Агрегируемость» эритроцитов сильноизменяется при патологиях, как показано в таблице 1.2. Её изучение может датьспецифическую информацию об изменениях свойств клетки. Факторы, определяющиеагрегируемость эритроцитов, подробно изучены в работах [43,61-63]. Следует такжеотметить, что практически отсутствуют работы, детально проверяющие сравнимостьАЭ в плазме и в растворах нейтральных макромолекул.Одна из причин изменения агрегируемости клеток - это возраст клеток: АЭзначительно изменяется от возраста клеток [43,64]. Эритроцит на протяжениипримерно 120-ти дневного цикла своей жизни значительно изменяет свои свойства, втом числе и агрегируемость, как показано на рисунке 1.6.

Параметры АЭ, измеренныена фракциях старых, средних и молодых эритроцитов (полученных высокоскоростнымцентрифугированием [65]), значительно отличаются [66,67]. При этом молодыеэритроциты агрегируют значительно слабее, чем старые эритроциты. Комплексныеисследования причины изменения АЭ с возрастом клетки заключают, что изменениесвойств эритроцитов связано со временем их нахождения в циркуляторной системе.Оно не зависит от изменений его деформируемости, поверхностного заряда,способности присоединять γ-глобулин, происходящих при старении клетки [43].

Этоособенно ярко наблюдается для проб крови от новорожденных, у которых эритроцитыимеют жизненный цикл порядка 30 дней, и отличия между фракциями значительноменьше [68]. Таким образом, отличие агрегируемости при патологиях может бытьсвязано с изменением продолжительности жизни эритроцитов.20Таблица 1.2.

Изменение агрегируемости эритроцитов при различных патологиях. Стрелкавверх означает увеличение агрегируемости эритроцитов [5].ПатологияАгрегируемостьАнгинаСсылка↑[69]нет эффекта[69]Бактериальнаяинфекция↑[69]Бета-Таласемия↑[70]Сердечный синдром X↑[38]Диабет второго типанет эффекта[32]Диабет второго типа↑[33]Синдром Гаучера↑[71]Гипертензиябеременных↑[72]Лепра↑[60]Патологическоеожирение↑[73]Нефротическийсиндромнет эффекта[74]Глаукома снормальным давлением↑[75]Серповидно клеточнаяанемия↑[76]Инфаркт Миокарда1.2.3.

Другие факторы, влияющие на агрегацию эритроцитовФорма эритроцита и его эластичность (деформируемость) играют значительныйроль в АЭ [77-81]. Эритроцит является высокоэластичной клеткой, комплекснорегулирующей свой объем, концентрацию ионов и форму [82]. Ослабление АЭнаблюдается при значительном снижении деформируемости эритроцитов, чтообъясняется тем, что эритроцитам тяжелее сформировать плотный контакт друг сдругом.Незначительноежеизменениедеформируемостиклетокнапротив,21увеличивает АЭ, что объясняется изменением свойств мембраны, усиливающим АЭ, вто время, как уменьшение деформируемости клетки, уменьшающее АЭ, еще мало.Предполагается, что АЭ усиливается за счет изменений окислительного стрессамембраны эритроцита при изменении его деформируемости [83,84].Рис. 1.6.

Агрегация эритроцитов для разных возрастных фракций клеток. Высокоскоростнымцентрифугированием разделены 10% молодых (TOP) и 10% старых (BOT) клеток; остальныеклетки считаются клетками среднего возраста. Измерен индекс АЭ в плазме и в растворедекстрана 70 кДа 3% [43].Агрегация эритроцитов изменяется и в зависимости от температуры. При этомизмерения, сделанные разными методами, не полностью согласуются, хотя общийхарактер зависимости повторяется, как показано на рисунке 1.7.

При понижениитемпературы эритроциты сильнее агрегируют. Механизм изменения АЭ остается всееще не известным [5,85,86]. Изменение АЭ наблюдаемое со временем in vitro послевзятия крови, не значительно [87].Параметры АЭ практически не изменяются впервые 4 часа после взятия крови даже при комнатной температуре и в течение 12часов при хранении при температуре 4°С.

При использовании специальных растворов22для хранения донорской крови в специальных пакетах агрегационные свойстваэритроцитов сохраняются в течение 14 дней [87]. АЭ также значительно изменяется отповерхностного заряда эритроцита, характеризуемого зета-потенциалом [88]Рис. 1.7. Температурная зависимость параметров агрегации эритроцитов, измеренных разнымиметодами. Наблюдается значительное увеличение АЭ с понижением температуры. Причинаразличий в зависимостях пока не установлена [86].

TSS (Threshold shear stress – пороговоесдвиговое напряжение) и CSS (Critical shear stress – критическое сдвиговое напряжение) –минимальные сдвиговые напряжение, останавливающее агрегацию эритроцитов иразрушающее агрегаты.1.3. Методы изучения агрегации эритроцитовАЭ характеризует состояние микроциркуляции крови и изучается уже напротяжениинесколькихдесятилетий.ИзмерениепараметровАЭявляетсяинформативным тестом при диагностике состояния организма. Для быстрого и точногоизмерения этих параметров были разработаны и апробированы различные методы,основанные на скорости оседании эритроцитов, оптической микроскопии [89,90],вискозиметрии при низких сдвиговых скоростях, измерении импеданса [91],фотоакустики [92], оптической фотометрии [31,93-96] и т.д..

В последнее время в23исследовательской и клинической практике для изучения АЭ стали применятьсяспециализированныекоммерческиеприборы,работающиенаосновеметодаоптической фотометрии – лазерные агрегометры [97-99]. Метод лазерной агрегометриибудет рассмотрен более подробно ниже.1.3.1. Оптическая агрегометерияЭтот метод был впервые предложен Zijlstra в 1958 году [100]. Он основан наанализе интенсивности лазерного излучения рассеянного на суспензии эритроцитов,находящегося в сдвиговом потоке либо в покое. Интенсивность рассеянного светакоррелирует со степенью АЭ, и с помощью нее можно получать параметры,характеризующие АЭ.Значительное преимущество этого метода по сравнению сдругими методами является возможность быстрого и точного измерения параметровхарактеризующих АЭ, которые чувствительны к различным патологиям.