Диссертация (Взаимодействие эритроцитов в средах, индуцирующих их агрегацию - исследование с помощью лазерных пинцетов)

На правах рукописиЛи КисунВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭРИТРОЦИТОВ В СРЕДАХ, ИНДУЦИРУЮЩИХ ИХАГРЕГАЦИЮ: ИССЛЕДОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ ЛАЗЕРНЫХ ПИНЦЕТОВСпециальность 03.01.02 - «Биофизика»ДИССЕРТАЦИЯна соискание ученой степени кандидата физико-математических наукНаучный руководительдоцент, кандидат физико-математических наукПриезжев А.В.Москва 2016ОглавлениеСписок используемых сокращений4Введение5Глава 1.

Обзор литературы121.1. Определение агрегации эритроцитов121.1.1. История открытия агрегации эритроцитов131.1.2. Физиологическая роль агрегации эритроцитов141.1.3. Агрегация эритроцитов при патологии151.2. Факторы, изменяющие параметры агрегации эритроцитов161.2.1. Факторы среды в агрегации эритроцитов: макромолекулы как проагрегантыи ингибиторы агрегации171.2.2.

Факторы клетки в агрегации эритроцитов. «агрегируемость» эритроцитов191.2.3. Другие факторы, влияющие на агрегацию эритроцитов211.3. Методы изучения агрегации эритроцитов231.3.1. Оптическая агрегометерия241.3.2. Методы и результаты изучения агрегации эритроцитов на уровнеиндивидуальных клеток271.3.3. Использование лазерных пинцетов для изучения агрегации эритроцитов321.4.

Гипотетические модели механизмов взаимодействия эритроцитов381.4.1 Модель «мостиков»391.4.2 Модель «обедненного слоя»41Глава 2. Материалы и методы452.1 Материалы452.1.1 Выбор растворов и крови452.1.2 Подготовка образца462.2 Лазерный пинцет482.2.1 Калибровка лазерного пинцета5022.2.2 Принцип измерения сил взаимодействия между эритроцитами с помощьюлазерного пинцета512.2.3 Обработка данных532.3 Сравнение измерений агрегации эритроцитов в образцах цельной крови и наиндивидуальных клетках54Глава 3. Измерение параметров агрегации эритроцитов с помощью лазерного пинцета563.1 Измерение параметров спонтанной агрегации эритроцитов563.2 Измерение параметров дезагрегации эритроцитов (прочности агрегатов)603.3 Сравнение параметров агрегации и дезагрегации эритроцитов, измеренныхна образцах цельной крови и на индивидуальных клетках66Заключение по главе 368Глава 4.

Механизм взаимодействия эритроцитов при их агрегации694.1. Модель «подвижных мостиков»704.2 Оценка энергии взаимодействия эритроцитов с помощью лазерного пинцета714.3 Заключение по главе 475Результаты и выводы76Благодарности78Список использованной литературы793Список используемых сокращенийАЭ – обратимая агрегация эритроцитовСАЭ – спонтанная агрегация эритроцитовДАЭ – дезагрегация эритроцитовЛП – лазерный пинцетFA – сила агрегацииFD – сила дезагрегацииFTRAP – сила захвата лазерного пинцетаA – линейное перекрытие эритроцитовS – площадь перекрытия эритроцитовE – энергия взаимодействия эритроцитовСЭМ – сканирующая электронная микроскопияАСМ – атомно-силовая микроскопияАМ – аспирация микропипетками4ВведениеАктуальность работыДиссертационная работа посвящена изучению биофизики взаимодействияэритроцитов в процессе их обратимой агрегации. В данной работе с помощьюлазерных пинцетов проведено детальное исследование взаимодействия эритроцитовпри их агрегации в различных, средах индуцирующих агрегацию эритроцитов (invitro).Способность к агрегации, является одним из важнейших свойств эритроцитов.Агрегация эритроцитов (АЭ) – это обратимый процесс образования и разрушенияагрегатов эритроцитов, который в значительной мере определяет вязкость крови принизких сдвиговых напряжениях.

Как следствие, АЭ значительно влияет наэффективность микроциркуляции крови и доставку кислорода к тканям. При этомстепень АЭ, т.е. насколько сильно эритроциты агрегируют, значительно изменяетсяпри большинстве социально значимых заболеваний (например, при диабете,гипертензии, малярии и многих других). Это делает исследование АЭ важной задачейкак для развития реологии крови как научного направления, так и для клиническойпрактики.Исследования АЭ проводятся уже на протяжении нескольких десятилетий. Восновном АЭ изучается в условиях in vitro ввиду того, что эксперименты по ееизучению в условиях in vivo очень сложны с реализации. В большинстве случаев, дляизмерения АЭ используют так называемый метод агрегометрии, в котором с помощьюанализа сигнала диффузного рассеяния лазерного излучения от образца цельной кровив покое после ее полной дезагрегации в сдвиговом потоке получают информацию окинетике спонтанной агрегации эритроцитов.

Реже используются такие методы, каканализ микроскопных изображений мазка крови, аспирация микропипетками, атомно5силовая и сканирующая электронная микроскопия, лазерный пинцет, которыепозволяют изучать взаимодействие отдельных эритроцитов.Процесс АЭ происходит только в присутствии макромолекул плазмы крови.Степень АЭ комплексно зависит от концентрации разных типов макромолекул –белков в плазме крови. Роль белков плазмы крови в АЭ подтверждается корреляциейизмеряемых параметров АЭ с концентрацией белков. При этом среди них основнуюроль играет белок фибриноген.

Однако до сих пор остается неясным, как именно белкиучаствуют в АЭ. В модельных растворах белков плазмы крови наблюдаетсясинергетический эффект: например альбумина с фибриногеном или γ-глобулином.Альбумин, не индуцирующий АЭ в отдельности от других белков, в значительнойстепени усиливает АЭ в присутствии фибриногена или γ-глобулина. Растворынекоторых синтетических нейтральных макромолекул, например, декстранов высокоймолекулярной массы (больше 40 кДа) также могут индуцировать агрегациюэритроцитов, отмытых от белков плазмы.

Синергетический эффект наблюдается и дляэтих нейтральных макромолекул, но как и для случая белков плазмы крови объясненияэтому явлению пока не дано. Важность изучения агрегации эритроцитов в растворахдекстрана связана с тем, что степень АЭ зависит также от свойств самих эритроцитов.Способность эритроцитов к агрегации называют «агрегируемостью» (aggregability)эритроцитов. Для разделения вклада среды (плазмы) и свойств самих эритроцитов встепень АЭ, параметры последней измеряются в заданных модельных растворах снейтральными макромолекулами, чаще всего декстраном 70 кДа. Измерениеагрегируемости эритроцитов особенно важно при патологических состояниях, прикоторых она может значительно изменяться, что служит индикатором изменениясвойств самих эритроцитов.

До сих пор точно не известно, какие именно изменения6эритроцитов приводят к изменению их агрегируемости, хотя имеются сведения о том,что агрегируемость эритроцитов зависит от их деформируемости.Следует отметить, что биофизика взаимодействия эритроцитов наиболеешироко изучена в модельных растворах нейтральных макромолекул. В то же время сплазмой и растворами белков работ очень мало.

На момент начала работы наддиссертацией были разработаны две гипотетические модели, описывающие механизмывзаимодействия эритроцитов на базе измерении АЭ в модельных растворахнейтральных макромолекул. Первая модель - модель «мостиков» («cross-bridges»)описывает взаимодействие эритроцитов как следствие образования связей (мостиков)между клетками за счет прикрепления макромолекул к мембранам соседних клеток.Вторая модель- модель«обедненного слоя» («depletionlayer»)описываетвзаимодействие эритроцитов за счет образования у поверхностности клетки слоя,обедненного макромолекулами, и возникающих вследствие этого осмотических сил.Обе модели все еще не получили согласованную экспериментальную проверку.

Темболее остается неизвестным применимость разработанных моделей для нативнойсреды (плазмы). Таким образом до сих пор не предложено модели, которая можетописать взаимодействие клеток при их агрегации. Не исключено, что это связано снедостатком ключевых экспериментальных данных, которые можно получить лишьпрямым измерением параметров взаимодействия эритроцитов.Один из возможных методов для получения необходимых экспериментальныхданных является лазерный пинцет.

В последнее время с изобретением лазерногопинцета (ЛП) был сделан прорыв в исследованиях в области биофизики, появиласьвозможность измерять силы взаимодействия отдельных клеток и макромолекул сточностью до долей пиконьютонов (пН). В ряде работ ЛП использовался для изучениявзаимодействия эритроцитов при их агрегации и были получены данные о динамике7взаимодействия клеток, которые до этого были недоступны.

Тем не менеесистематического изучения агрегации эритроцитов данным методом еще не былопроведено.Таким образом к началу выполнения диссертационной работы были не до концаобоснованы модели, описывающие взаимодействие эритроцитов при их агрегации всредах, близких к нативным таких, как плазма или сыворотка крови, растворы белковкрови. Также оставалась непонятной роль отдельных белков и их комплексов в АЭ. Небыло сделано сравнение параметров агрегации эритроцитов в модельных растворахнейтральных макромолекул и в нативных средах.ВданнойработеЛПиспользовандлясистематическогоизучениявзаимодействия эритроцитов при их агрегации и дезагрегации в зависимости отсостава среды, в которой находятся клетки.Измерения были проведены ваутологичной плазме и сыворотке крови, в модельных растворах белков плазмы крови(фибриногена и альбумина) и нейтральных макромолекул (декстрана с м.м.