Диссертация (Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования), страница 9

К сожалению, длякомпьютерногомоделированияэтообщаяпроблема:толькобелки,полученные методом ЯМР имеют структуру, конформация которой полученав растворе, но это очень малый процент белков. Поэтому, как правило,исследования стартуют с кристаллической формы белка.Названия и некоторые особенности структур РНК полимеразы E.coliперечислены в Таблице 2.3.Для того, чтобы оценить, насколько разные получаются структуры σ70субъединицы в кристалле и как они зависят от лигандов было проведенопопарноевыравниваниесподсчетомRMSDотклонение) в программе MaxCluster [68] по формуле56(среднеквадратичное=где di - расстояние между выбранной парой атомов двух сравниваемыхбелков,N-числопардлясравнения.RMSDподсчитываетсясиспользованием суперпозиции белков таким образом, чтобы достичьТаблица 2.3Структуры РНК полимеразы E.coli избанка данных RCSB PDB.Цветом в первом столбце отмечены группы структур, полученных порезультатамкластеризациимассивапопарныхRMSDмеждуσ70-субъединицами.

Цветом во втором столбце отмечены группы с одинаковымнабором аминокислот в стpуктуре.ЛигандНазваниеструктурыв PDBбанке4YLORNA DNA4YLNRNA DNA4YLPRNA DNA4YFKsquaramide 84LJZ4YFNSquaramide 144LK0T7 Gp24MEXsalinamide A4MEY4LK14LLGGp24YG24JKRppGpp1SIG4YFXmyxopyronin BФамилияавтораZuoZuoZuoMolodtsovBaeMolodtsovBaeFengFengBaeBaeMurakаmiZuoMalhotraMolodtsov57Наличие контактамежду σ70субъединицей илигандом++++-Разрешение,Å6.05.505.503.573.593.823.913.903.953.843.793.704.202.603.844KMURifampinMurakami4KN4Benzoxazinofir Murakami4KN7Benzoxazinofir Murakami4JK2pppGppMurakami4JK1ppGppMurakamiминимального значения. Выравниваниебелков3.853.963.694.203.90проводилосьсиспользованием матрицы вращения Кабсча [69, 70].Была построена таблица попарных RMSD для 20 вариантов σ70субъединицы (Таблица 2.4). На основе этих данных была проведенаиерархическая кластеризация методом одиночной связи [71].Таблица 2.4.01.5600.451.5901.720.631.69001.021.791.011.781.670.461.670.650.88000.690.80.991.60.71.62.592.282.632.292.292.242.330584JK24KN74KN44KMU4YFX1SIG4JKR4YG24LLG4LK14MEY4MEX4LK04YFN4LJZ4YFK4YLP4YLN2.762.442.722.352.372.392.51.66001.491.082.582.442.562.452.852.492.854MEY4LK14MEX4LK04YFN4LJZ4YFK4YLP4YLN4YLO4YLOМатрица попарных RMSD для структур σ70-субъединицы.0.1200.090.11000.190.180.150.280.280.250.23001.291.261.261.251.261.231.241.231.241.241.39001.731.881.681.631.641.651.651.61.621.611.581.571.831.51.64001.041.731.61.741.481.481.511.511.51.080.91.791.51.781.41.411.441.441.451.651.6721.282.241.751.741.771.781.771.641.671.991.232.191.731.731.751.761.750.531.11.691.491.671.481.481.51.51.491.010.771.551.561.61.521.531.531.551.540.650.831.731.431.671.441.441.471.481.460.880.391.691.471.771.461.471.51.521.52.272.362.452.392.32.252.252.252.252.252.382.522.432.542.542.372.372.352.352.342.482.622.592.412.372.442.432.432.422.424LLG4YG24JKR1SIG4YFX4KMU4KN44KN74JK24JK1В результате кластеризации было выявлено два больших кластера,которые отмечены цветом в Таблице 2.3.

Это важный момент, посколькунаиболее близкие структурно варианты белка могут использоваться вкачестве донора аминокислот для достраивания недостающих частей белка.Для того, чтобы выбрать наиболее полную структуру для достраиваниябыла составлена Таблица 2.5, в которой структуры разбиты на группы поколичеству отсутствующих в них аминокислот.Из Таблицы 2.5 видно, что лучше всего для достраивания подходятструктуры 4LK1 и 4LLG, содержащие нерасшифрованные участки в 6, 38, 46и 7 аминокислот. Самый большой пустой участок в 46 аминокислот междуаминокислотами 167 и 213 частично перекрывается аминокислотами изструктуры 1SIG, Рис. 2.3.

RMSD между структурами 4LK1 и 1SIG составляло1.24, тогда как между 4LLG и 1SIG оно равнялось 1.6. Таким образом, стало59возможным выбрать структуру-донора. Было проведено выравниваниеструктур 4LK1 и 1SIG, после чего недостающий участок из 1SIG былдобавлен в 4LK1, после чего было проведено достраивание недостающихучастков белка с помощью программы FALC-Loop [72].Таблица 2.5.Имеющиеся в структурах σ70-субъединицы аминокислоты.Название структурыНомера содержащихся в структуреаминокислотYLO, YLP, YLN79-171, 210-6134YG2, 4YFK, 4LJZ, 4LK094-167, 213-236, 243-6134YFX, 4KMU, 4KN4, 4KN7, 4JK1, 4JK295-154, 212-6094MEX, 4MEY95-107, 114-165,210-273, 242-6124LK1, 4LLG7-56, 94-167, 213-236, 243-6134JKR95-171, 210-6131SIG113-167, 173-191Далее полученная полная структура σ70-субъединицы без пропусковбыла использована в моделировании в растворах солей с концентрациейионов 0 мМ; 20 мМ NaCl и 5 мМ MgCl2; 40 мМ NaCl и 5 мМ MgCl2; 40 мМNaCl в течение 150 нс.

Для сравнения, было проведено моделированиенеполной структуры σ70-субъединицы 4IGC.60324LK11SIG10160170180190200210220Рисунок 2.3 Аминокислоты, присутствующие в структурах 4LK1 и 1SIG, по оси х отмечены их номера2.2.2 Результаты и обсуждениеРезультаты структурного выравнивания всех кристаллических структурσ70-субъединицы после 150 нс моделирования показали довольно высокоесоответствие друг другу. Наиболее сильно отличались между собой и отдругих структур те варианты σ70-субъединицы, которые взаимодействовали сДНК. Остальные лиганды не повлияли на структуру белка.

При этом такжене было выявлено корреляции между количеством известных оснований всравниваемых структурах и их сходством. По всей видимости, на точнуюструктуру кристалла влияли, в первую очередь, условия его получения, таккак из таблицы 2.4. видно хорошее соответствие фамилии автораполученным кластерам. Также стоит отметить, что несмотря на невысокоеразрешение в 4Å в эксперименте, структуры демонстрируют большоесходство, в пределах 2 Å.По результатам моделирования мономеров с полной структурой былообнаружено, что наибольшей подвижностью обладают области N и С концовбелка, Рис.2.4. И если подвижность N конца подтверждается наличиемпропусков в структуре, полученной методом РСА, то подвижность C-концаможетобъясняться функциональной чувствительностью к ионной силераствора, в котором содержится белок.

В таком случае, при отсутствии ионов61в кристалле будет наблюдаться одна и та же структура С-конца белка, тогдакак в растворе могут наблюдаться различные варианты конформаций.На основе результатов моделирования полимеризации σ70-субъединицынами было показано, что одна из областей контакта внутри фибриллы – это Nи С-концы белка, формирующие структуру наподобие "клешней".АБВГДЖЗЕИРисунок 2.4. Результаты моделирования полной σ70-субъединицы при разных концентрациях солей: А- начальная структура после добавления недостающих участков пептидной цепи, Б - σ70-субъединицапосле 150нс моделирования с 0 концентрацией ионов, В - белок после 150 нс моделирования в 20мМNaCl и 5 мМ MgCl2, Г - белок после 150 нс моделирования в 40 мМ NaCl, Д - белок после 150нсмоделирования в 40 мМ NaCl и 5 мМ MgCl2.

Цветом выделены регионы: 1.1(7-100АК) - зеленый,NCR (127-370) - красный, 2.3(416-434АК) - оранжевый, 2.4(435-453АК) - желтый, 4.1(536-565АК) розовый, 4.2(566-613АК) - голубой. Е-И - результаты структурного выравнивания между вариантомструктуры Г(выделен красным цветом) и вариантами А-Д (выделены синим цветом) соответственно.62В моделировании дополненной σ70-субъединицы при концентрации40мМ NaCl была обнаружена структура, отличная от структуры σ70субъединицы при других концентрациях (Рис.

2.4 Г): в данном случае«клешни» были раскрыты, и внутренние области N- и С-концов оказалисьдоступны для контакта. Именно при концентрации 40мМ NaCl вэкспериментах АСМ наблюдалась самая высокая скорость образованияамилоидных фибрилл.В моделировании наиболее структурно стабильным участком оказаласьобласть, выделенная на рис 2.4.

А-Д красным, соответствующая домену NCR(non conservative region, 127-370 АК). Структурное выравнивание, в целом побелку дающее различие в RMSD от 16 до 20 Å, в случае этого домена давало1,83 Å для структур Г и Д, 1,80 Å для структур Г и В, 1,87 Å для структур Г иБ, а также 1,97 Å для структур Г и А. Длина стабильной области составляла250-300 АК.В статье [73] показано, что С-конец белка, а именно регион 4.2 (566613)отвечает за распознавание промотера ДНК, а регион 1.1 (1-100 АК)соответствующий N-концу белка, ингибирует этот регион в случае, когда σ70субъединица находится не в составе РНКП. Однако, в модели не быловыявлено контакта между регионами 1.1.

и 4.2.Рис. 2.4, тем не менее, демонстрирует некоторые общие тенденции,характерные для поведения мономера σ70-субъединицы, находящегося не всоставе РНКП. Все структуры Б-Д, по сравнению с начальной структурой Аиз кристалла, показывают более компактное расположение домена 4(голубойи розовый), для всех кроме Г близкое к остальным частям молекулы, вособенности к области 190-198 АК из домена NCR(красный). В своюочередь, домен 1.1(зеленый), по данным статей [74-75] предположительногидрофобно взаимодействующий с доменами 2.3 и 2.4. (оранжевый ижелтый), расположен на удалении от них. В целом, структура Г63демонстрирует более похожее на начальное взаимное расположение доменов,что может обуславливать ее повышенную способность кфибриллообразованию за счет свободного домена 4.

При этом визуальноструктура Г больше напоминает структуру в фибрилле, когда N- и C-концыразведены, а внутренняя часть белка, домен 2, доступна для контакта сдругим белком.Поскольку моделирование не выявило близость доменов 2 и 4,описанную в литературе, можно предположить, что механизмысамоингибирования и фибриллообразования различны, хотя и используютодни и те же участки белка.Был также подсчитан заряд различных областей белка. Аминокислоты,дававшие отрицательный заряд - это GLU и ASP, положительный - LYS иARG.

Для областиNCR 127-370 АК, соответствующей устойчивойструктуре белка, заряд составил -27 е, 4.1 домен с 536 по 565 АК имел заряд+2 е, 4.2 домен 566-613 АК имел заряд 0. N-конец с 7 по 100 АК имел заряд 17 е. Таким образом, в целом нейтральный регион 4 не можетэлектростатически взаимодействовать с сильно заряженными регионами 2 и1.1.