Диссертация (Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования), страница 13

Все модели подвергалисьэнергетической минимизации в 1000 шагов и уравновешиванию в NVT иNPT ансамблях (системы с постоянными количеством частиц, температуройи объемом либо давлением) по 200пс с двумя энергетическими группами.Все подложки а также синтезированная молекула GM дополнительномоделировались в вакууме а затем в воде в течение 10 нс, для проверкистабильности структуры. При моделировании систем с подложкамииспользовалисьпериодическиеграницысвключеннойфункциейperiodic_molecules, т.е. подложки были бесконечны по осям xy.Для моделирования фибриногена была взята структура 3GHG из банкаданных PDB-структур, полученная методом РСА с разрешением 2.9 Å [134].В ней были оставлены и использовались далее цепи G, H, I, J, K, L и 4относящихся к ним иона Ca.

Все прочее было удалено. Структура имеетпропуски в следующих цепях: G: 1-26, 201-562; H: 1-57, 460-461; I: 1, 393411; J: 1-26, 213-562; K: 1-57, 460-461; L: 1-4, 396-411. Суммарный зарядфибриногена (без учета Ca) получился -21. дисульфидных связей 27.Для построения подложек использовались дополненные силовые поля,подробно описанные в Главе 2.3. В каждом конкретном случае топология92подложки строилась с помощью команды x2top, позволяющей из координататомов и информации о связях между ними создать файл топологии. Приэтом учитывались периодические границы: размер системы по осям х и усоставлял число, кратное размеру элементарной ячейки подложки, поэтомуатомы подложки образовывали связи через границы системы, таким образом.при сдвиге подложка сохраняла свою целостность, а краевых эффектов невозникало.3.3.2Результаты и обсуждениеБыла проведена короткая симуляция(5 нс, суперкомпьютер Ломоносов,256 процессоров)в среде NAMD адсорбции фибриногена в вакууме наповерхность оксида кремния (моделировал слюду), и модифицированныйметильными группами оксид кремния(Рис 3.8).Рисунок 3.8 Фибриноген после 1 нс симуляции на оксиде кремния (А) и HMDS (С), после 5 нс наоксиде кремния (В) и HMDS (D)Предварительные данные показали очень хорошее соответствиеданных АСМ и моделирования (таблица 3.4).Таблица 3.4Сравнение данных моделирования и АСМ-эксперимента по адсорбциифибриногена на слюду и слюду, модифицированнуюгексаметилдисилозаном.93СлюдаВысота (D-ГМДС-слюдаДлина, нмдомен), нмАСММДВысота (D-Длина, нмдомен), нм2.2 ± 0.442 ± 71.2 ± 0.460 ± 97.5345.541Можно заметить, что результаты моделирования и экспериментаизменяются в том же самом направлении, что и подложка.

Модельвоспроизводит известный эффект, что высота уменьшается, а длинаувеличивается на более гидрофобной поверхности.Мы можем предположить, что несоответствие между экспериментом имоделированием связано с отсутствием αC-областей в модели. Хотяпоследовательность аминокислот αC-домена в среднем гидрофильна(средняя гидрофобность GRAVY = -0.994), более важно, как этот доменструктурирован. На сегодняшний день у нас нет этой информации, и мы неможем исключить, что присутствие αC-доменов делает молекулу нагидрофобной подложке немного длиннее, чем в моделировании.

Такжеважно отметить, что, хотя конечные конформации расценены какустойчивые, могут иметь место очень медленные процессы разворачиваниябелка на гидрофобных поверхностях.Было проведено моделирование молекулы фибриногена на графит вводно-солевом растворе в среде GROMACS (Рис. 3.9) в течение 100 нс.АБРисунок 3.9 Адсорбция молекулы фибриногена на графит после (А) 60 нс (Б)110 нс моделирования94Адсорбция произошла примерно на 80 нс моделирования. При этомпрактически с самого начала моделирования вместе с движением кповерхности подложки молекула фибриногена начала изгибаться, чтопоказано на Рисунке 3.10.Рисунок 3.10 Молекула фибриногена после 60 нс моделирования в растворе 15 мМ NaClТакое поведение молекулы не наблюдалось в предыдущих моделях, вводно-солевом растворе конформация молекулы стабильна. На АСМснимках хорошо видно, что молекулы фибриногена выстраиваются вдольосей симметрии графита.

Возможно, изгиб молекулы происходит ненепосредственно на поверхности подложки, а еще в растворе.3.3.3ВыводыВообще, результаты моделирования хорошо согласуются с нашимиданными AСM и с результатами других исследователей. Интерпретируярезультаты МД-моделирования, можно прийти к заключению, что различие ввысотах D домена фибриногена на гидрофобной и гидрофильнойповерхностях главным образом зависит от их гидрофобности, но не отместоположения α-C доменов. Следует отметить, что в случае большихмолекул промежуточная стадия моделирования в вакууме существенносокращает время моделирования, что было продемонстрировано на примерефибриногена: через 4 нс после добавления воды к высушенной в вакуумесистеме наблюдалась устойчивая адсорбция и существенные95конформационные изменения (фибриноген на слюде и модифицированнойслюде), тогда как в водной среде процесс приближения молекулы к подложкеидет крайне медленно (фибриноген на графите).

Использовать болееогрубленные методы моделирования, не учитывающие подвижность белка, вданном случае не представляется возможным, так как после началаадсорбции на графит молекула фибриногена начала изгибаться, а из-забольшого размера процесс этот может сильно затянуться, пока не произойдетприлипание молекулы к поверхности подложки по всей длине.Использование огрубленного моделирования на данной стадии приведет кошибкам в итоговой конформации.3.4Исследование адсорбции лизоцима на поверхностьслюды методами АСМ и МДВ качестве объекта для апробации предложенного ранее методасовместной трактовки данных был выбран белок лизоцим из белка куриногояйца.

Он имеет массу 14,3 кДа, состоит из единственной полипептиднойцепи, содержащей 129 аминокислотных остатков, pI=11. Это глобулярныйбелок, имеет эллипсоидную форму с размерами 2,8*3,2*3,0 нм, принейтральномрНположительнозаряжен.Вработеиспользовалсяшестикратно кристаллизованный лизоцим японской фирмы SeikagakuCorporation.Лизоцим положительно заряжен в чистой воде, поэтому он охотноадсорбируется на поверхности отрицательно заряженных слюды и графита.Это делает возможным построение модели адсорбции на временах,характерных для современной молекулярной динамки. Симуляция адсорбциилизоцима уже была построена ранее Кубиак и другими [135-137], эти данныеиспользовались в настоящей работе в качестве эталона.Своей популярностью среди исследователей лизоцим обязан двумфактам: во-первых, это амилоидный белок, образующий фибриллы на96поверхностях при определенных легко достижимых условиях[138-140]; вовторых, при иммобилизации на поверхностях он способен к дальнейшейагрегации, образуя конгломераты, причем этот процесс может идти и принейтральном рН, и в отсутствии ионной силы [141].

При определенныхусловиях возможен рост кристаллов, который наблюдался многимиисследователями с помощью АСМ[142].3.4.1Материалы и методыДля визуализации мономеров лизоцима использовались микроскопыNanoscope III фирмы Digital Instruments и FemtoScan, разработанный вЛаборатории сканирующей зондовой микроскопии Физического факультета.Сканирование проводилось в резонансной моде в режиме прерывистогоконтакта.Использование резонансной моды обусловлено тем, что это режимпрерывистого контакта, в котором воздействие зонда на поверхностьневелико.

Этот режим был выбран, так как изучались легко деформируемыеобъекты – белки. Белок наносился на подложку путем физической сорбции,что означает его высокую латеральную подвижность; этот факт такжетребовалиспользования«полуконтактного»режима.Вработеиспользовались стандартные кантилеверы фирм MicroMash и НИИФП, атакже ультраострые кантилеверы Клинова с радиусом закругления 1нм.В основе идеи уточнения данных атомно-силовой микроскопии пообъектам заданного размера и формы, находящимся под поверхностьюобразца, лежит использование двухпроходного режима АСМ.В каждой строке совершается следующая процедура.

На первомпроходеснимаетсяАСМизображениерельефавконтактномили«полуконтактном» режиме. Затем кантилевер отводится от поверхности нарасстояние z0, и осуществляется повторное сканирование. Расстояние z097выбирается таким образом, чтобы сила Ван-дер-Ваальса была меньше силыэлектрического или магнитного взаимодействия.На втором проходе датчик перемещается над поверхностью потраектории, повторяющей рельеф образца. Поскольку в этом случаелокальное расстояние между зондовым датчиком и поверхностью в каждойточке постоянно, изменения изгиба кантилевера в процессе сканированиясвязаны с неоднородностью электрических или магнитных сил, действующихна зонд со стороны образца.Рельеф поверхности, получаемый при первом проходе – это траекториязонда, обусловленная не только реальной топографией, но и искажениями,возникающимивсистеме.Этиискажениявсоставетопографиивоспроизводятся и при втором проходе, вызывая искажения изображенияэлектрическихилимагнитныххарактеристикобразца.Еслиэтихарактеристики имеют известный паттерн, по нему возможно восстановитьневозмущенную топографию.В работе исследовался процесс адсорбции лизоцима из водногораствора на поверхность слюды.