Диссертация (Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования)

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТимени М. В. ЛомоносоваФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТна правах рукописиТолстова Анна ПавловнаАНАЛИЗ ДАННЫХ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ СПОМОЩЬЮ КОМПЬЮТЕРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯСпециальность 03.01.02 - БиофизикаДИССЕРТАЦИЯна соискание ученой степени кандидата физико-математических наукНаучные руководители:д. ф.-м. н., профессор Твердислов В.А.к.ф.-м.н.

Дубровин Е. В.Москва - 2015г.ОглавлениеВведение ............................................................................................................... 4Глава 1.Анализ состояния методов молекулярной динамики и атомно-силовой микроскопии в приложении к исследованию класса белков снеструктурированными участками ................................................................... 141.1 Компьютерное моделирование биомакромолекул методоммолекулярной динамики ................................................................................. 141.2 Стадии компьютерного моделирования биополимеров методоммолекулярной динамики.

................................................................................ 171.3 Некоторые ограничения и проблемы метода молекулярной динамики 251.4 Сканирующая зондовая микроскопия и ее возможности ....................... 281.4.1Принципы работы сканирующих зондовых микроскопов ............ 291.4.2Атомно-силовая микроскопия.........................................................

321.4.3Особенности зондовой микроскопии белков ................................. 341.5 Существующие методы коррекции и уточнения изображений атомносиловой микроскопии биополимеров ............................................................ 37Глава 2.Разработка метода молекулярной динамики в приложении ксравнению данных с данными атомно-силовой микроскопии ..................... 422.1 Исследование качества локальной энергетической минимизации дляуточнения структур, полученных методом РСА ........................................... 422.1.1Методы .............................................................................................

432.1.2Результаты и обсуждение ................................................................ 492.1.3Выводы ............................................................................................. 542.2 Исследование проблемы предсказания структуры нерасшифрованныхчастей белка ..................................................................................................... 552.2.1Методы ............................................................................................. 5622.2.2Результаты и обсуждение ................................................................

612.2.3Выводы ............................................................................................. 662.3 Создание силовых полей для подложек .................................................. 662.3.1Строение и параметризация силовых полей в среде Gromacs....... 672.3.2Параметризация для графита. .........................................................

702.3.3Параметризация для молекулы GM. ............................................... 712.3.4Параметризация для подложек из оксида кремния........................ 742.3.5Результаты и обсуждение ................................................................ 77Глава 3.Исследование биологически важных конформаций классабелков, имеющих неструктурированные участки, методами МД и АСМ ...

793.1 Фибриллообразование σ70-субъединицы РНК полимеразы E.coli ......... 793.1.1Результаты и обсуждение ................................................................ 823.1.2Выводы .............................................................................................

893.2 Исследование адсорбции фибриногена на модифицированныеповерхности слюды и графита. ...................................................................... 893.2.1Материалы и методы ....................................................................... 923.2.2Результаты и обсуждение ................................................................

933.2.3Выводы ............................................................................................. 953.3 Исследование адсорбции лизоцима на поверхность слюды методамиАСМ и МД ....................................................................................................... 963.3.1Материалы и методы ....................................................................... 973.3.2Результаты и обсуждение. ............................................................. 1063.3.3Выводы ...........................................................................................

108Заключение ....................................................................................................... 109Благодарность................................................................................................... 112Список литературы .......................................................................................... 1133ВведениеВ настоящее время в связи с ростом производительности компьютероввозрослоколичествоэкспериментовпоизучениюконформационныхпреобразований белков in silico, дающих результаты, превосходящиеэкспериментальные.

Полноатомная молекулярная динамика (МД) – метод,позволяющийатомистическоймоделироватьточностью.структурныеОднако,онапревращенияограниченабелкаскачествомиколичеством белковых структур в банках данных. На сегодняшний день надолю структур белков, полученных методом рентгеноструктурного анализа(РСА), приходится 89.7% [1]. Разрешение этого метода составляет в среднем2,5 Å. Большинство исследуемых белков имеют подвижные области, которыене могут быть кристаллизованы, что приводит к появлению пропусков вструктуре.Моделированиетакихструктур,вкоторыхотсутствуютнекоторые аминокислоты, приводит к спорным результатам. В настоящеевремя ведется активная разработка теоретических методов, позволяющихпредсказывать структуру этих участков.Например, гомологическоемоделирование – весьма успешный метод предсказания, опирающийся насуществующую "шаблонную" структуру, сходную по аминокислотнойпоследовательности с моделируемым белком. Однако, получаемая в итогеструктура будет ближе к шаблону, чем к белку-цели.

В результатенесовершенства содержащихся в банках данных исходных структур белков,полученных методом РСА, возникает проблема верификации данныхмолекулярной динамики с помощью эксперимента.Атомно-силовая микроскопия (АСМ) является на данный моментодним из наиболее адекватных методов изучения морфологии отдельныхбелков с субмолекулярным разрешением в условиях, приближенных кфизиологическим (в растворах). Она позволяет получать уникальные данныео структуре, свойствах и динамике различных белков и их комплексов.Однако как влияние подложки, так и недостижимость атомного разрешенияАСМнамягкихобъектах(какими4являютсябелки)затрудняютинтерпретацию результатов, и зачастую не позволяют определить структуруи ориентацию тех или иных белковых доменов на АСМ-изображении илилокализоватьобластивзаимодействиябелковыхмолекул.Дляосуществления такой интерпретации требуется научно обоснованныйподход, который бы учитывал взаимодействие белковых молекул междусобойисповерхностьюподложки.Применениедляэтихцелейполноатомной молекулярной динамики позволит не только выяснитьособенности взаимодействия белков in vitro в разных биологически важныхконформациях, но также и в условиях пространственных ограничений (наподложке) и развить подходы для совместного анализа данных АСМ и МД.Цель и задачи исследованияЦель работы - выяснить физические особенности взаимодействиякласса белков, имеющих неструктурированные участки, in vitro и в условияхпространственных ограничений (на подложке) с помощью атомно-силовоймикроскопии и полноатомной молекулярной динамики для развитияметодологии анализа данных (преодоление молекулярного разрешения, учётароли подложки) атомно-силовой микроскопии.Для этого были выбраны два белка, σ70-субъединица РНК-полимеразыEscherichia coli и фибриноген человека.

Оба белка обнаруживают склонностьк амилоидному фибриллообразованию в нативных условиях, которое былохорошо изучено в АСМ исследованиях. Оба белка имеют нерасшифрованныеучастки трехмерной структуры. Так у фибриногена отсутствует информацияоб αС-цепях, предполагаемых участках связывания между белками внутрифибриллы. В данной диссертации исследовался процесс адсорбции одноймолекулы фибриногена на различные по своим физическим свойствамповерхности методами АСМ и молекулярной динамики с последующимсравнением полученных результатов.У σ70-субъединицы РНК-полимеразы E.coli не расшифрованы дванебольших участка внутри белковой глобулы (с 1по 5, с 66 по 94 и с 155 по5211аминокислотноеоснование).Вданнойработеисследовалосьфибриллообразование σ70-субъединицы методами АСМ и компьютерногомоделированияметодоммолекулярнойдинамикиспоследующимсравнением результатов.Для выяснения возможности применять результаты компьютерногомоделирования к трактовке и повышению информативности данных АСМбыло проведено моделирование адсорбции молекулы белка лизоцима изкуриного белка, и сравнение полученных результатов с данными АСМ.Лизоцим хорошо изучен и не имеет нерасшифрованных участков.Были поставлены следующие научные задачи:1) Анализ состояния методов молекулярной динамики и атомносиловой микроскопии в приложении к исследованию классабелков с неструктурированными участками.2) Разработка метода молекулярной динамики в приложении ксравнению данных с данными атомно-силовой микроскопии3) Исследование биологически важных конформаций класса белков,имеющихнеструктурированныеучастки,методамимолекулярной динамики и атомно-силовой микроскопии1.Научная новизнаВпервые построена молекулярная модель фибриллы σ70-субъединицы РНК полимеразы E.coli.2.Впервыепостроенымоделиσ70-субъединицыРНКполимеразы E.coli с восстановленными участками структуры приразной ионной силе.3.ПостроенамодельсинтетическоймолекулыGraphiteModifier(GM).4.Впервые промоделирована адсорбция GM на поверхностьграфита.65.Впервыепостроенамодельслюды,покрытойгексаметилдисилозаном.6.Получена модель адсорбции лизоцима на поверхностьслюды.7.Предложенметодполучениятопологииповерхностиадсорбированного белка.Научная и практическая значимость работыРезультаты работы имеют как практическую, так и научнуюзначимость.

Результаты экспериментов, а именно выяснение характерныхмест связывания молекулформирующихструктурыσ70-субъединицы РНК полимеразы E.сoli ,типа«бусинананити»,которыезатемпредположительно сворачиваются в спираль, формирующую фибриллу,представляют ценность как для ученых, занимающихся исследованиемкомплекса бактериальной РНК полимеразы и выяснением свойств и функцийотдельных белков в этом комплексе, так и для ученых, решающих общую длямногих белков проблему возникновения амилоидных фибрилл.Данные об адсорбции фибриногена на различные поверхности хорошокоррелируют с данными АСМ-исследований и дополняют их, позволяясделать вывод о характере взаимодействия с подложками αС-цепей,подтверждая таким образом одну из двух теорий, разрабатываемых наданный момент ведущими учеными в этой области.