Диссертация (1102344), страница 6
Текст из файла (страница 6)
При наблюдении в жидкости удаетсяизбежать типичных загрязнений поверхности образца при его высушиванииот раствора. Однако здесь самое важное для биолога - это возможностьисследовать биологически важные процессы in vitro и на границе разделажидкость/твердое тело. Для белков это особенно важно, так как ихконформация зависит от состояния окружения, и высушивание белковогообразца не даст правильной информации о его структуре[46].При прямой адсорбции молекул белка на подложку горизонтальныеразмеры в режиме прерывистого контакта получаются завышенными из-зауширения, вызванного конечным радиусом кривизны зонда.Кажущаяся высота молекул белка в режиме прерывистого контакта присканировании в жидкости также оказывается завышенной. Существуетнесколько возможных объяснений этого эффекта[47].Во-первых, кажущееся изменение высоты может быть обусловленоупругимисвойствамимягкихбелков.Представимсебемысленныйэксперимент.
Пусть зонд сканирует над физически однородным образцом,35где присутствует только топографический рельеф. При приближении квозвышению расстояние между острием зонда и поверхностью сокращается,вызывая снижение амплитуды резонансных колебаний зонда. Тогдапьезокерамика будет удалять образец от зонда до тех пор, пока не будетвосстановлено прежнее значение амплитуды. Теперь вообразим себетопографически однородный образец, включающий область, где сильнопритяжение между поверхностью и зондом.
Над этой областью зонд будетпритягиваться к образцу, что вызовет уменьшение зазора между ними и, какследствие, снижение амплитуды колебаний. Обратная связь начнет удалятьобразец, и на изображении это будет выглядеть как наличие в данной областитопографического возвышения. Если белок адсорбирован на слюде, тообластям топографических неровностей присущ отличный от подложкихарактер взаимодействия с острием зонда. Таким образом, изображение врежиме прерывистого контакта отражает не только топографическуюкартину, но и характер сил взаимодействия между образцом и зондомодновременно.Во-вторых, взаимодействие между зондом и образцом может бытьвызвано локальным изменением заряда из-за электростатических свойствбелка.В-третьих, не исключено, что белки непрерывно движутся схарактерным временем порядка миллисекунд, что близко к периодурезонансных колебаний кантилевера.
При работе с белками не стоитзабывать, что белок не является неподвижной системой, и каждой молекулеприсущи собственные внутренние движения[48].В-четвертых,белокможетбытьокруженшубойслабоадсорбированных ионов и молекул, что приводит к увеличению кажущихсяразмеров.36ПомимопрямойвизуализациибелковАСМоткрываетновыевозможности их изучения, недоступные другим методам[45]. Например,непосредственное измерение сил адгезии между лигандами и рецептором, вчастности, биотином и стрептавидином [49, 50], путем регистрациизависимости отклонения зонда от расстояния до поверхности.
Отрыв зондаот поверхности происходит в момент, когда сила адгезии достигаетмаксимального значения. Полученная величина силы составляет десятыедоли наноньютона, что достаточно для надежной регистрации в АСМ.Аналогичным образом можно использовать антитело в качествесенсора на антиген и регистрировать узнавание антигена антителом [51].Кривая зависимости силы от расстояния при приближении зонда с антителомк поверхности, покрытой антигеном, имеет характерную форму, из которойможнополучитьинформациюобузнаванииисвязыванииоднойединственной пары антиген-антитело, а из обратной ветви кривойопределить величину силы их взаимодействия.1.5Существующие методы коррекции и уточненияизображений атомно-силовой микроскопии биополимеровЗадача восстановления реального профиля объекта по его АСМизображению является важнейшей задачей теории АСМ.
Она возникает из-заналичия артефактов,прежде всего таких, как уширение изображения,проминание мягких объектов и др. В общем виде эта задача являетсямногопараметрической и поэтому ее решение затруднительно.Большинство эффектов, приводящих к искажению изображений ивозникновению артефактов (дефекты пьезосканера, шумыэлектроники,акустические и сейсмические шумы), могут быть устранены программно илимеханически.
Наибольшую проблему представляют эффекты, возникающие37случайным образом непосредственно в момент сканирования (изменениеформы зонда и деформация образца), и потому являющиеся неустранимыми.Современныепрограммыобработкиизображений,полученныхметодами зондовой микроскопии, используют широкий ряд алгоритмов,позволяющих проводить всесторонний анализ данных.Однако все этиалгоритмы не учитывают специфику объекта, следовательно, не в состоянииубрать те искажения, которые вызваны особенностями исследуемойповерхности.
Также ни один самый новый и мощный метод компьютерногоанализа не даст информации о том, где на изображении находятся искомые, агде примесные объекты такого же размера и формы.Темнематематическихменее,следуетпакетов,отметитьвходящихвдостоинствасоставсуществующихпрограммобработкиизображений. Наиболее удобные и полезные опции, которые такие пакетыпредлагают – это увеличение резкости, фильтр Винера (убирает случайныйшум),выравниваниенеровностьюповерхностиподложкиили(убираетдрейфоммакрорельеф,вызванныйпьезокерамики),анализшероховатости, пороговая фильтрация (позволяет выделить и отдельнообработать объекты заданной высоты), выделение зерен, Фурье-анализ, учетнеидеальности формыиглы (используются морфологические фильтры,применяющиеся после выбора пользователем предполагаемой формы иглы).По существу, такая обработка не дает новой информации, и точность методане повышается.
Программным методом нельзя установить форму зондаточно, и тем самым учесть вносимые им искажения. Для этого следуетиспользовать дополнительные экспериментальные данные.В работе [52] предложена универсальная компьютерная методикадеконволюции АСМ-изображений, включающая два этапа: определениегеометрии используемого острия с помощью тест-объектов и сверткуинвертированной геометрии с измененным АСМ-профилем. Эта процедура38позволяет во многих случаях восстановить исходный профиль объекта свысокойточностью.Однаковосстановленныеподаннойметодикегоризонтальные размеры объекта существенно завышены при условии, чторадиус кривизны объекта меньше радиуса кривизны кончика зонда [53](случай, как правило, реализующийся при АСМ-исследовании белков ибелково-нуклеиновых комплексов).Задачу восстановления объема исследуемых частиц по АСМ-профилютакже можно решить без стадии предварительного тестирования зонда, а спомощью анализа одного и того же АСМ-изображения [53], однако, даннаязадача сводится к рассмотрению геометрии контакта сферического зонда исферического образца.
Но модель сферической геометрии образца, какправило,малоподходитдлявосстановленияреальнойгеометрииадсорбированных биологических образцов из-за их взаимодействия как скантилевером, так и самой подложкой, которое обычно приводит кдеформации исследуемых мягких объектов. Более общей является модель,позволяющая учесть эффект уширения при контакте иглы с частицей,имеющей эллипсоидальное сечение. Решение данной задачи позволяетопределить объём частицы, выразив его через параметры эллиптическогосечения: найденного значения a и связанного с высотой частицы значенияb=h/2 [52].Эти методики хороши при наличии только сил Ван-дер-Ваальса.Однако в реальности сила взаимодействия зонда с образцом зависит от ихфизических и химических свойств, что приводит к завышению илизанижению реальных размеров объекта[53].На практике оказывается, что, несмотря на развитый математическийаппарат, используемый при обработке изображений, зондовая микроскопияпо сей день остается в большей мере иллюстративным методом в дополнениек другим, более точным.39Выводы и постановка задачиВ результате анализа современных работ по теме исследования былопоказано, что только лишь методом молекулярной динамики не может бытьисследован класс белков, имеющих неструктурированные участки.
Такжепоказано,чтоточностьметодаМДограниченаразрешениемэкспериментальных методов получения исходных структур.В свою очередь, метод АСМ не достигает разрешения, достаточногодля построения молекулярных моделей исследуемых белков.Поэтому, как показывает анализ современных научных трудов,выполненный выше, актуальной научной задачей является изучениефизическихособенностейвзаимодействияклассабелков,имеющихнеструктурированные участки, in vitro и в условиях пространственныхограничений (на подложке) с помощью атомно-силовой микроскопии иполноатомной молекулярной динамики для развития методологии анализаданных (преодоление молекулярного разрешения, учёта роли подложки)атомно-силовой микроскопии и молекулярной динамики.Выполнение этой научной задачи являлось целью данной диссертации.Для этого были сформулированы следующие задачи.I.Анализ состояния методов молекулярной динамики и атомносиловой микроскопии в приложении к исследованию классабелков с неструктурированными участками.В рамках этой задачи был выполнен анализ особенностей, областиприменимости, достоинств и недостатков, ограничений методов АСМ и МД.II.Разработка метода молекулярной динамики в приложении ксравнению данных с данными атомно-силовой микроскопииВ рамках данной задачи были поставлены следующие подзадачи:1) Исследование качества локальной энергетической минимизациидляуточненияначальнойметодом РСА40структурыбелков,полученных2) Создание моделей подложек и адекватной параметризации длявыбранного силового поля3) Исследование проблемы предсказания структуры отсутствующихчастей белкаIII.Исследование биологически важных конформаций класса белков,имеющихнеструктурированныеучастки,методамимолекулярной динамики и атомно-силовой микроскопииВ рамках данной задачи были поставлены следующие подзадачи:1) Моделирование фибриллообразованияполимеразы E.coliσ70-субъединицы РНКи сравнение результатов моделирования сданными АСМ2) Моделирование адсорбции фибриногена на перечисленные вышеповерхности и сравнение результатов моделирования с даннымиАСМ, построение модели адсорбции фибриногена в воде.3) Моделирование адсорбцииметодомМД,получениелизоцима на поверхность слюдытопологииповерхностимоделиадсорбированного белка и сравнение этой топологии с даннымиАСМ отдельных молекул лизоцима на слюде41Глава 2.Разработка метода молекулярной динамики в приложении ксравнению данных с данными атомно-силовой микроскопииВторая глава посвящена вопросам применимости метода компьютерногомоделирования белков с неструктурированными участками, полученныхметодом РСА, к совместной трактовке данных, полученныхэкспериментальными методами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
