Диссертация (Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования), страница 11

На рисунке 2.9 показана система после 10 нс моделирования.Рисунок 2.9 100 молекул GM на графите после 10 нс моделированияБольшинство молекул адсорбировались на графит, при этом образуяструктуры, похожие на шпильки (Рис. 2.10).Рисунок 2.10 Адсорбированные на поверхность графита молекулы GM после 10 нс моделирования вводеКогда через 5 нс большая часть молекул совершила адсорбцию награфит, к системе было добавлено еще 100 молекул, и далее моделированиепроходило для двух систем, содержащих 100 и 200 молекул GM.2.3.4 Параметризация для подложек из оксида кремнияСлюда имеет структуру слоистого алюмосиликата из двухтетраэдрических слоёв [AlSi3O10]4−, между которыми находитсяоктаэдрический слой из катионов К. Общая формула мусковитаKAl2(AlSi3O10)(OH)2[79]. Один слой слюды состоит из одногооктаэдрического слоя алюминия, расположенного между двумя74тетраэдрическими кремниевыми листами.

В качестве модели для слюды былиспользован аналог верхнего слоя слюды, кристаллический оксид кремния,поверхностный заряд которого σ=-0.0217e/Å2 [80]примерно равенповерхностному заряду слюды σ=-0.021e/Å2[81] . Подложка содержала атомыкислорода и кремния в тригональной кристаллической решетке, срасстоянием 1,61Å между атомами и зарядами 1,2 е на кремнии и -0,6 е накислороде. Поверхностные атомы кислорода образовывали водороднуюсвязь, таким образом, на поверхности образовывался гидроксильный слой.Слюда, модифицированная гексаметилдисилозаном (Рис. 2.11 А) [82],имела следующую модель.

Для получения HMDS-модифицированной слюдык кислороду гидроксила вместо водорода пришивалась молекула -Si-(CH3)3 ,(Рис.2.11 Б), размеры подложки в ангстремах: dx=500 dy=150 dz=13Si-O-HАSi-O-Si(CH3)3БРисунок 2.11А) Структура гексаметилдисилозана (Б) модификация оксида кремниягексаметилдисилозаномДля получения топологии в силовое поле были добавленыхарактеристики для атомов оксида кремния, взятые из справочников[83-87].АБРисунок 2.12 Модель (А) слюды (Б) модифицированной гексаметилдисилозаном слюдыДля этого в поле были добавлены новые характеристики дляграничных атомов кремния и атомов HMDS.

Получившаяся структура75показана на Рис.2.12.Атомы в подложке имеют amber99sb-ildn типы: SI для кремния, OS дляуглерода, OH для кислорода, HO для водорода гидроксила, HA для водородаметильной группы.Парциальные заряды атомов таковы:1.1896 на Si в решетке0.5526 на Si в Si(CH3)3-0.2000 на C-0.5948 на O между двумя Si в решетке-0.6974 на O между Si и H-0.7000 на O между Si в решетке и Si в Si(CH3)30.4000 на H в SiOH0.050 на H в Si(CH3)3суммарно подложка не заряжена.Дополнительная параметризация для AMBER:[ BONDTYPES ]SI OS10.16100SI OH 600.000SI CT3 500.000885.11.67001.8700[ ANGLETYPES ]SIO1SI1 144.000118.400OSSIOS1 109.500791.200O2SIOS1 109.500791.200O2SIOH1 109.500791.200SIOHHO1 113.000292.880OHSIOH1 109.47791.20076O2SICT1 109.50418.400CTSICT1 109.50418.400NONBONDEDSISI1428.080000.000A3.38550e-01 2.44704e+00Стабильность структуры была проверена при тестовом моделированиив вакууме в течение 1 нс а также в воде в течение 10 нс.

В результате не былозамечено каких-либо артефактов и далее было начато моделированиеадсорбции молекулы фибриногена.2.3.5 Результаты и обсуждениеБыли построены работоспособные модели используемых в АСМподложек. Поведение белков при адсорбции подтверждает адекватностьпредложенной параметризации, полученные данные из экспериментов поадсорбции хорошо коррелируют с данными АСМ. Были измереныповерхностные заряды получившихся подложек. Для свежесколотой слюдыσэксп=-0.021 e/Å2 тогда как σмод=-0.024 e/Å2. Для слюды, модифицированнойгексаметилдисилозаном, поверхностная плотность заряда неизвестна, вмодели она составила σмод=-0.0213 e/Å2.Обнаружение шпилек из молекул GM на графите возможно объясняетламели, из которых состоит плотный слой GM на графите.

Ширина однойламели составляет 2,7 нм по данным АСМ экспериментов (данные пока неопубликованы), тогда как длинная сторона шпильки составила 2.3±0.3 нм.Следует отметить, что большая величина стандартного отклонения отсреднего значения для длины шпильки обусловлена тем, что системанаходится на начальных стадиях адсорбции. Для более точных измеренийтребуется привести систему в состояние равновесия, что подразумеваетпродолжение моделирования.

Можно заметить, что молекулы GM в целом77имеют тенденцию выстраиваться по осям симметрии графита, что такжеподтверждается АСМ экспериментами.78Глава 3.Исследование биологически важных конформаций классабелков, имеющих неструктурированные участки, методами МД иАСМ3.2Фибриллообразование σ70-субъединицы РНКполимеразы E.coliσ70-субъединица РНК полимеразы E.сoli – небольшой белок, входящийв состав холофермента РНК полимеразы, и отвечающий за инициациютранскрипции конститутивных генов [88]. Трехмерная структураполноразмерной сигма-субъединицы РНКП в свободном состоянии остаетсянеизвестной. В то же время, исследователям удалось расшифроватьструктуру отдельных фрагментов σ70 -субъединицы E. coli [89]. Былообнаружено, что структура индивидуальных доменов сигма в свободномсостоянии очень сходна с их структурой в составе холофермента РНКП [90].σ70-субъединица в свободном виде не взаимодействует с промоторами.

Былопредложено несколько механизмов, объясняющих ингибированиесвязывания ДНК свободной σ70-субъединицей [91-94], однако, до настоящеговремени не получено данных, которые бы однозначно свидетельствовали впользу какого-либо из них.В последнее время появились исследования, докладывающие оформировании σ70-субъединицами агрегатов при условиях близких кнативным [95-97]. Исследование морфологии и физико-химических свойствбелка может пролить свет на механизм фибриллообразования.В данной работе изучалось формирование амилоидных фибрилл σ70субъединицы РНК полимеразы кишечной палочки а также ее модификаций вводно-солевом растворе с помощью пакета программ молекулярнойдинамики Gromacs [98,99] в силовом поле Amber99-ildn [100] с заданнойконцентрацией ионов.79Известно, что в околофизиологических условиях σ70-субъединицы РНКполимеразы кишечной палочки образуют амилоидные фибриллы.

Этотпроцесс был изучен с помощью атомно-силовой микроскопии[101,102]. НаАСМ-изображениях было обнаружено два типа фибрилл: палочкообразные ичервеобразные (Рис. 3.1). Червеобразные структуры σ70-субъединицы РНКПE.coli rpoD 800, формирующиеся во время их термической инактивации,Рис. 3.1 АСМ-изображение червеобразных фибрилл сигма-субъединицы на графитеσ70субъединицыРНКП E.coli в буфере с концентрацией солей 20 мM NaCl и 5 мM MgSO4 полученные(a) в том же буфере (б) на воздухе после высушивания образца. В средней колонке представленыувеличенные изображения червеобразных структур из областей, отмеченных на АСМ изображенияхслева с соответствующими римскими цифрами (размер увеличенных областей 150×150 нм).

Праваяколонка демонстрирует распределение высот вдоль белых линий с центральных изображений.80впервые были обнаружены с помощью электронной микроскопии в раннихработах Лоуэ [103]. Присутствие таких же червеобразных агрегатов частоупоминается в работах по изучению агрегации амилоидогенных белков ипептидов. Однако, в некоторых работах такие структуры рассматриваютсякак ранняя стадия формирования амилоидных фибрилл [104, 105] тогда как вдругих работах червеобразная агрегация представляла альтернативныйнеамилоидный[106-108]илиамилоидный[109,110]путьфибриллообразования.Задачейданнойфибриллообразованияработыбылоизучитьранниестадиии получить адекватную модель червеобразныхфибрилл, объясняющую данные эксперимента.Материалы и методыСтартовая структура для моделирования была получена из PDB-банкаструктур, а именно из структуры РНКП холоэнзима 4IGC полученногометодом РСА с разрешением 3,70 Å [111].

Оба варианта σ70-субъединицы,представленные в pdb-файле, имели пропуски, был выбран наиболее полныйвариант, в котором отсутствовали аминокислоты с 1по 5, с 66 по 94 и с 155по 211 (Рис.3.2). Заряд такого белка был -12 е, тогда как заряд целого белкабыл -44е. N- и С-концы белка (аминокислоты ~1-65 и 540-609), формируют«клешни» (на рисунке окрашены зеленым), а неконсервативную область вдиапазоне 130-360 аминокислотных остатков мы назвали NCR,nonconservative region (на рисунке окрашены красным).Рисунок 3.2 PDB-структура сигма-субъединицы 4IGC. Зеленым отмечены N- и С-концы белка (Nконец сверху), красным отмечена область NCR81Компьютерные модели строились в программном пакете Gromacs 4.6.5ссиловымполемAmber99sb-ildn насуперкомпьютере«Ломоносов»суперкомпьютерного комплекса МГУ имени М.В.

Ломоносова[112]Все варианты систем белков окружались водно-солевым раствором,модель воды TIP3P[113], с концентрацией NaCl 20мМ и MgCl2 5мМ.Расстояние между белками в начальных позициях составляло не меньше 1,5нм для димеров, и не меньше 3 нм в случае последующей полимеризации.Радиус обрезания кулоновских и Ван-дер-Ваальсовых сил составлял 1 нм.Для моделирования электростатического взаимодействия использовалсяметодсуммированияпоЭвальду[114].Всемоделиподвергалисьэнергетической минимизации в 1000 шагов и уравновешиванию в NVT иNPT ансамблях (системы с постоянными количеством частиц, температуройи объемом либо давлением) по 100пс с двумя энергетическими группами.Для ограничений движения атомов использовался алгоритм LINCS [115].Для исследования фибриллообразования целого белка пропуски вструктуре были заполнены с помощью программы MODLOOP [116].

Оконтакте судили с помощью программы Contact Map, VMD [117]. Длявизуализации данных использовалась программа Yasara[118]3.2.1БылпроведенРезультаты и обсуждениеколичественныйанализАСМ-изображенийчервеобразных фибрилл. Эти агрегаты имеют структуру «бусины-на-нити».Расстояние между бусинами варьирует от 15 до 20 нм, средняя высота«бусины» составляет 4.2±0.6 нм для АСМ в жидкости и 2.9±0.5нм для АСМна воздухе. Этот размер превосходит размеры единичной молекулыбелка(1.8±0.3 и 4.1±0.6 нм для АСМ на воздухе и в воде соответственно),поэтому мы предполагаем, что «бусины» содержат по крайней мере двамономера σ70-субъединицы. Для оценки механических параметров фибриллмы измеряли их персистентную длину. Для этого мы использовали подход,основанныйна цепочечной модели фибриллы, который ассоциирует82флуктуацииконтурачервеобразнойфибриллыстемпературнымиколебаниями и описывается Гауссовым распределением угла θ между двумятангенсами к контуру фибриллы, разделенными длиной контура l:N(θ(l))2D=(P/2πl)0.5exp(−Pθ2/2l),гдеP–персистентнаядлина(3.1)фибриллы[119].Тогдаполучаемследующее выражение, связывающее персистентную длину, расстояниемежду звеньями и угол между звеньями:<θ2(l)>=l/P,(3.2)которое дает возможность рассматривать персистентную длину каккоэффициент в линейной функции <θ2(l)>2D=f(l).Персистентная длиначервеобразных фибрилл зависела от концентрации солей в растворе,уменьшаясь с ростом концентрации.