Диссертация (Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования), страница 7

Рассматриваются проблемы, вытекающие изнесовершенств исходных структур белков для моделирования, а такженекоторые ограничения молекулярной динамики в связи с несовершенствомбаз данных структур твердых тел.2.1Исследование качества локальной энергетическойминимизации для уточнения структур, полученных методом РСАКлючевым ресурсом для анализа атомных структур белков насегодняшний день является Брукхэвенский банк данных PDB [24].90%структур этого банка получены методом рентгеноструктурного анализакристаллов белков. Самые точные из структур PDB обладают разрешением0,54 Å. В среднем же по банку оно составляет 2,2 Å, что приводит кнеточностям в стартовых структурах для моделирования. Дальнейшееразвитие экспериментальных техник данного метода не приводит кзаметному увеличению точности ожидаемых поступлений. Вместе с остройнеобходимостью улучшать уже исследованные структуры, это придаётактуальность разработкам универсального метода уточнения белковыхструктур, который позволил бы перейти от структур PDB-банка к идеальнораспознанной структуре белка в кристалле.Одним из возможных путей решения этой проблемы являетсяприменениеметодовэнергетическаяпараметровдлямолекулярнойминимизация.этихмеханики,Однакометодовне42такихпроблемаможеткаквыборабытьлокальнаярасчетныхрешенапрямойэкспериментальной проверкой предсказанных конформаций и оставляетмного открытых вопросов об универсальности применения молекулярноймеханики в задаче уточнения.

Выбрав наиболее перспективный методсилового поля, мы поставили задачу проверитьпригодность локальнойэнергетической минимизации, проведенной с его использованием дляуточнения PDB-структур разного разрешения, статистическим методом[54].Под уточнением здесь и далее подразумевается приближение разрешеннойструктуры белка к его истинному состоянию в кристалле.2.1.1 МетодыВвиду особенностей рентгеноструктурного метода (всегда есть ошибкисвязанные с качеством кристалла и с определением длины волны), несуществует эталонных структур, с которыми можно было бы производитьсравнение.Для некоторых белков в PDB-банке данных могут быть найденыструктуры, соответствующие одному и тому же белку и отличающиесямеждусобойлишьзначениемэкспериментальногоразрешениякристаллической структуры (шириной пика дифракционной картины) илитехникой последующей обработки данных дифракции.

Это позволяет считатьлокальную энергетическую минимизацию пригодной для уточнения структурPDB-банка, если с её помощью удастся привести структуры большегоразрешения к структурам меньшего разрешения.Исходнопредполагая,чтолокальнаяминимизацияявляетсяуниверсальным методом уточнения, тем самым можно постулировать, чтоминимизация структур одного белка, отличающихся лишь разрешением,приведет структуры в единую конформацию минимума энергетическоголандшафта белка. То есть применение локальной минимизации к структурамодного белка должно значительно уменьшать геометрические различия43между ними.В противномслучаеисходноепредположениебудетопровергнуто.Мы предъявляем дополнительные требования к проводимому анализу,считая необходимым доказать не просто возможность уточнения структуркакого-либо одного белка [55], а принципиальную применимость локальнойэнергетической минимизации как универсального метода уточнения в рамкахвсего PDB-банка данных.

Эти требованиявыражаются в необходимостипровести многоуровневый статистический анализ над выборкой многихбелков, из структур разного разрешения которых построены пары сравнения.В этих парах предполагается выявить уменьшение геометрических различийпосле энергетической минимизации.С учетом этих требований была произведена выборка белков из PDBбанка, для которых доступно несколько структур, абсолютно идентичных всвоей последовательности и образуемых ими комплексах, а также во всехпараметрах выделения и кристаллизации, кроме отличий в дифракционнойкартине и методах её обработки. Для этого изначально использовалиськластеры95-процентных совпадений последовательностей - результатеженедельной кластеризации белков PDB-банка методом BLAST.

В составполученных кластеров, помимо белков, входили также отдельные домены,которые были отсеяны, поскольку минимизация изолированных доменовзаведомо не позволяет уточнить структуру белка в целом в силу ненулевыхзначений индивидуальных для белка междоменных взаимодействий. Далееиз рассмотрения были исключены все белки, для которых явным образом небыло указано значение pH для условий кристаллизации, а затемвсекластеры, содержащие один элемент. Затем была проведена повторнаякластеризация так, чтобы внутри каждого кластера находились структурытолько одного и того же белка. Из нескольких сотен оставшихся структур изPDB-банка, упорядоченных в кластеры, были отобраны лишь те, для которыхвнутрикластеранаходиласьструктуры,44абсолютноидентичныепопараметрам ионного окружения, по температуре кристаллизации, попоследовательности аминокислот, по входящим в структуру органическим инеорганическим комплексам.

Таким образом, единственные различия междуструктурамиодногокластеразаключаютсявпараметрахточностиразрешения.Отобранные таким образом белки (таблица 2.1), структуры которыхподлежат геометрическим сравнениям, представляют собой случайнуювыборку по функциональным свойствам и принадлежат к разнымэволюционным классам, что позволяет считать выборку репрезентативной.Таблица 2.1Пары PDB структур, выбранные для сравнения.PDBкодРазрешение, PDB код Разрешение,РазницаСреднееAAразрешений, разрешение,AA4PCY2,155PCY1,800,351,984PCY2,156PCY1,900,252,035PCY1,806PCY1,900,101,851GM42,051UPD1,400,651,731GMB2,001UP91,350,651,681RCC2,401RCI2,000,402,202UWT2,502UWV2,130,372,322UXJ2,252UXL2,880,632,572UXK2,312UXM2,700,392,511XUF1,901XUG1,500,401,701C5H1,551C5I1,800,251,682AL11,502AL21,850,351,68451HAU1,901HAW1,900,001,90Важно отметить, что в некоторых структурах с низким значениемразрешения встречались аминокислоты и отдельные атомы, имеющиенесколько вариантов возможного расположения, из которых невозможновыбрать наиболее верный в силу недостаточной точности дифракционнойкартины.

Для последующих вычислений энергии в ходе минимизации, атакже для вычисления структурной разницы между белками в случаемножественного задания в файле координат атома из PDB-банка выбиралсяпервый из вариантов.Для доказательства репрезентативности выборки по типам белков,представленных в ней, была исследована зависимость попарныхгеометрических различий между структурами кластера от разницыразрешений внутри пары. Оценивая геометрические различия методомструктурного выравнивания Frtmalign [56], в котором осуществляетсяминимизация среднеквадратичных расстояний между Cα-атомами (RMSD)сравниваемых структур путем их недеформирующего наложения(суперимпозиции), мы получили график 2.1a. Из графика 2.1a видно, чтозакономерность, полученная O. Carugo для одного белка [57], не наблюдаетсяв случае выборки разных белков. Более того, точки, соответствующие парамструктур одного белка, также не лежат на одной прямой.

Анализ этойзависимости показал, что структурные различия одного и того же белка,определенного с разными разрешениями, зависят не только от разницыразрешений, но и от свойств белка, которые, однако, не могут быть сведены кучету длины его последовательности и количеству цепей, входящих в егосостав. Для всей выборки не обнаружено корреляции RMSD с разницейразрешений структур, в том числе и при различных вариантах нормировкиRMSD на длину последовательности белка. Эти же рассуждения верны и длязависимости структурных различий от среднего разрешения в паре (график462.1б), а также от величины разницы разрешений, нормированной на среднеезначение разрешений в паре (график 2.1в).Рисунок 2.1 Графики зависимости RMSD (а) от разницы разрешений структур, (б) от нормированнойна среднее разрешение разницы разрешений, (в) от средней величины разрешения для пары.47Приведенные соображения позволяют рассматривать значения RMSDдля всех пар как распределение случайной величины (рис.

2.2a). В этомслучаестатистический анализэффективности уточнениясведетсякисследованию смещения распределения по RMSD. Исходное предположениео значительном уменьшении геометрической разницы структур в парахстатистически подтвердится, если аналогичное распределение, полученноепосле минимизации каждой структуры, позволит выявить существенноеуменьшение среднего значения, принципиально не изменив характерараспределения.Минимизация структур, а именно поиск конформации локальногоэнергетическогоминимума,конфигурационномпроизводимыйпространствекоординатизначальнойбелка,точкивсоответствующейисходной PDB структуре, может быть осуществлена квази-Ньютоновымметодом численной оптимизизации. При этом в качестве оптимизируемойфункции выступает полная энергия белка, которая, в свою очередь,вычисляется методами молекулярной механики.Уточнение структур определяется в первую очередь точностью поискаконформации локального энергетического минимума каждой из структур.Положение локального минимума на энергетическом ландшафте белка вкристаллеопределяетсявпервуюочередьВан-дер-Ваальсовымивзаимодействиями.

В связи с этим выбор силового поля для расчета полнойэнергии белка в рамках минимизации должен производиться таким образом,чтобы наиболее точным образом учесть межатомные взаимодействия внутрибелка. Многие белки исследуемой выборки содержат коферменты, а такжеионыметаллов,аминокислотныхсвязанныеостатковкоординационнымиилисвязямигетероатомамиснебелковойатомамичасти.Распространенные программы, предназначенные для уточнения белковыхструктурприпомощилокальнойэнергетическойминимизациисиспользованием методов силового поля, обеспечивают учет растворителя, но48исключают из структуры белка как ионы металлов, так и некоторыенебелковые части в процессе обработки исходной PDB структуры [58].

Этимбыла продиктована необходимость использования в настоящей работесобственнойпрограммылокальнойэнергетическойминимизацииввакуумном окружении по методу силового поля MMFF94 [59], провереннойи откалиброванной с использованием библиотеки химических соединенийMMFF Validation Suite и позволяющей осуществить вычисление полнойэнергии с учетом координационных связей ионов металлов.Мыиспользоваликвазиньютоновский(АлгоритмБройдена—Флетчера — Гольдфарба — Шанно (BFGS)) метод[60] численной локальнойоптимизации для нахождения локального энергетического минимума белкакак функции координат всех его атомов в PDBструктуре. Последняя былаиспользована в качестве исходной структуры для минимизации.

Длявычисления градиента использовалась двухточечная разностная схема сшагом 10-7Å. Для нахождения конформаций с минимальной энергией мыиспользовали следующие параметры: максимальное число итераций было10000, последние 256 шагов минимизации сохранялись в памяти, алгоритмперезапускался,еслинебылоуменьшенияэнергииввыбранномнаправлении. Затем, если было более чем 32 перезагрузки в течениепоследних 256 шагов, алгоритм минимизации, наконец, переходил в простойградиентный спуск с максимальным количеством шагов 1000.Таким образом мы получали минимизированные структуры. Этиструктуры были сгруппированы в те же пары, и мы получали новоераспределение RMSD минимизированных структур в парах.2.1.2 Результаты и обсуждениеКонформации,минимуму,соответствующиеполученныедлялокальномукаждой структуры,энергетическомуиспользовались дляпостроения нового распределения RMSD (рис. 2.2б).