Диссертация (Анализ данных атомно-силовой микроскопии с помощью компьютерного моделирования), страница 10

Однако, в случае небольшого участка региона 4.2 (голубой) в 585-596АК, мы видим электростатическое взаимодействие с регионом 190-204, аименно GLU198, 199 - ARG 596; ASP 202, 204 - GLU 585, LYS 593 дляконцентрации 20мМ NaCl и 5 мМ MgCl2 , ARG584 - ASP 191-193, GLU194,ASP195 для концентрации 0 мМ и т.д.На рис. 2.5.показана карта зарядов сигмы при концентрации 20мМNaCl и 5 мМ MgCl2.

Из рисунка видно, что крупных заряженных областейвнутри белка мало, найденная область контакта между NCR и 4 доменом вобщем-то единственная. При этом из рисунка 2.4. видно, что для высокихконцентраций солей, т.е в структурах Г и Д, контакта между регионом 4.2. иобластью 190-205 АК нет. Возможно, именно отсутствие этого контакта и64Рисунок 2.5. Карта зарядов σ70-субъединицы. Желтым отмечены лизин и аргинин, положительныеаминокислоты, зеленым - глутаминовая кислота и аспарагин.

Красным овалом отмечена областьсильного отрицательного заряда в домене NCR, притягивающая домен 4.2обуславливает полимеризацию, так как больше крупных заряженныхобластей в белке нет, а полимеризация чувствительна к ионной силераствора, и значит, должна иметь в целом электростатическую природу.В рамках этого эксперимента было проведено компьютерное исследованиемедленных конформационных изменений неполной σ70-субъединицы придвух разных уровнях ионной силы: при концентрации 20мМ NaCl, 5 мМMgCl и при 50мМ NaCl, 5мМ MgCl2.

Молекулы моделировались в водносолевом растворе в течение 100 нс. Было обнаружено, что конформационныеизменения затрагивают в первую очередь концевые области белка (см.Рис.2.5), что подтверждается изменением скорости фибриллообразования вэксперименте in vitro и результатами моделирования полной σ70субъединицы.АБРисунок 2.6. Конформация сигма-субъединицы после 100нс моделирования в растворе 20мМ NaCl, 5мМ MgCl2 (А)и 50мМ NaCl, 5мМ MgCl2 (Б).65Второй вариант(Б) показал расхождение N- и С концов белка, тогда какв первом случае(А) N- и C- концы вступили в контакт.2.2.3 ВыводыВ результате моделирования дополненной структуры σ70-субъединицыРНКП E.coli было обнаружено два варианта расположения С-концевогодомена 4 белка.

В одном из них, при низкой концентрации солей в растворе,домен 4 взаимодействует с сильно отрицательно заряженной областью 190200АК домена NCR. В другом высокое содержание солей приводит кэкранированию заряженной области NCR и домен 4 становится свободен,что приводит к росту скорости полимеризации. Сходные результатыполучены для неполной σ70-субъединицы при разных концентрациях. Онатакже демонстрирует два варианта конформации. Однако, поскольку Nконец неполной σ70-субъединицы не соединен с остальной частью белка никовалентно ни через дисульфидные мостики ни через водородные связи,результаты этого исследования демонстрируют лишь выраженныйэлектростатический характер связи между концевыми доменами.Таким образом, несмотря на использование неточных методовпредсказания структуры белка, удалось минимизировать области дляпредсказания и получить положительные результаты моделирования,подтверждающиеся другими исследователями.

Также удалось выяснитьнеизвестный ранее контакт между доменом 4.2 и заряженной областью NCRдомена.2.3Создание силовых полей для подложекСовременное компьютерное моделирование с помощью молекулярнойдинамики, как правило, применяется для изучения белков и белковыхкомплексов, включающих органические лиганды и, реже, липидные слои.Показавшие себя наиболее стабильными и близкими к реальности силовыеполя бывают весьма ограничены в количестве представленных химических66соединений[2-4]. Даже набор атомов весьма мал. Силовые поля,предназначенные для моделирования кристаллических твердых тел, неподходят для моделирования белков, поскольку не содержат нужныхсоединений.

Для моделирования адсорбции белков на поверхность подложек,используемых в АСМ, потребовалось создать параметризацию для основныхсиловых полей, используемых для моделирования белков: AMBER, OPLS иCHARMM. Были выбраны подложки из свежесколотого графита,модифицированного GM графита, свежесколотой слюды имодифицированной гексаметилдисилозаном слюды. Для них былиподобраны коэффициенты перед соответствующими членами силового поля.2.3.1 Строение и параметризация силовых полей в среде Gromacs.Параметризация для всех подложек строилась в программном пакетеGromacs 4.6.5.

В нем силовые поля имеют вид совокупности файлов , вкоторых в виде таблиц содержатся коэффициенты для подстановки вуравнение силового поля для каждого атома.На основе этих коэффициентов программа создает файл топологии дляобъекта моделирования, в котором для каждого атома прописаныпарциальный заряд, тип атома, наличие связей с соседями, углы иторсионные углы связей.Для создания дополнительной параметризации для новых атомов илисоединений мы использовали файлы силового поля ffnonbonded.itp,ffbonded.itp и atomname2type.n2t. В первом файле содержится информация окаждом отдельном несвязанном атоме силового поля. Это егохарактеристики и коэффициенты для электростатического и Ван-дерВаальсова членов уравнения силового поля.

Например, для атомовпептидной связи в силовом поле OPLS она будет выглядеть так:; name bond_type at.number mass67charge ptypesigmaepsilonopls_001 C612.011000.500A3.75000e-01 4.39320e-01opls_002 O815.99940-0.500A2.96000e-01 8.78640e-714.00670-0.570A3.25000e-01 7.11280e-11.008000.370; SIG01 ; SIGopls_003 N01 ; SIGopls_004 HA0.00000e+000.00000e+00где в первом столбце хранится имя атома,во втором – его тип, который будет учитываться при образованиисвязей,в третьем – атомный номер,в четвертом - масса в атомных единицах массы,в пятом – заряд атома,в шестом – тип частицы (A – атом, V – виртуальная частицавзаимодействия, S – оболочка),в седьмом и восьмом хранятся коэффициенты Ван-дер-Ваальсовавзаимодействия, σ и ε (см уравнение 1.7).

Для каждого поля используютсясвои единицы, в OPLS σ измеряется в нанометрах, а ε в кДж/моль.Количество описанных в силовом поле атомов не равно количествусоответствующих им химических элементов. Атом углерода может иметьнесколько десятков записей, различающихся по именам в зависимости оттого, какой заряд, тип связанного атома и какие коеффициенты Ван-дерВаальса они имеют.68Второй файл, ffbonded.itp. содержит данные о связях между атомами.Поскольку в уравнении силового поля несколько членов отвечают завзаимодействие связанных атомов, информация делится на несколько групп,по числу слагаемых уравнения.

В силовом поле их три: растяжение изуравнения 1.4 описывается группой данных под заголовком [ bondtypes ],изгиб из уравнения 1.5 описывается группой данных под заголовком [angletypes ], торсионное взаимодействие из уравнения 1.6 описываетсягруппой данных под заголовком [ dihedraltypes ].В группе [ bondtypes ] содержатся длины связей всех атомов, запись длясилового поля OPLS выглядит так:[ bondtypes ];ij funcb0SIO10.161OWHW10.09572 502080.0 ; For TIP4F Water - wlj 1/98C*HCCC31kb885.10.10800 284512.0 ;1 0.15220 265265.6 ;Здесь i, j – типы связанных атомов из первого файла ffnonbonded.itp,второй столбик; func - тип связи, b0 и kb – коэффициенты при члене 1.4уравнения силового поля 1.1, отвечающем за растяжение связи междуатомами i и j.В группе [ angletypes ] содержатся значения углов между всемикомбинациями троек атомов, встречающихся в химических соединениях,описываемых данным силовым полем.

Запись для силового поля OPLSвыглядит так:ijkfuncth0kth69SIO1SI1 144.000118.400OSSIOS1 109.500791.200O2SIOS1 109.500791.200где i, j, k – типы связанных атомов из первого файла ffnonbonded.itp,второй столбик; func - тип связи, th0 и kth – коэффициенты при члене 1.5 изуравнения силового поля, отвечающем за изгиб связи.Аналогично, в группе [ dihedraltypes ] содержатся значенияторсионных углов между всеми комбинациями четверок атомов,встречающихся в химических соединениях, описываемых данным силовымполем, и соответствующие коэффициенты.2.3.2 Параметризация для графита.Графитовая подложка моделировалась из одного слоя графена, в двухсиловых полях: OPLS и AMBER. Атомы в подложке имели OPLS и AMBERтип С.

Парциальный заряд атомов графита был равен нулю. Расстояниемежду атомами в гексагональной упаковке было 1.418 Å.Дополнительная параметризация для AMBER была такова:[ BONDTYPES ]C C1 0.14180 374049.6[ ANGLETYPES ]CCC1 120.000527.184NONBONDEDC612.010.0000 A 3.39967e-01 3.59824e-01Дополнительная параметризация для OPLS была такова:[ BONDTYPES ]CC1 0.14180 392459.2 ; TRP,TYR,PHE70[ ANGLETYPES ]CCC1 120.000527.184 ; PHE(OL)NONBONDEDC612.0110.0A3.84423e-013.08863e-01Параметры для торсионных углов не вводились и при симуляции ихэнергия не рассчитывалась.Стабильность структуры была проверена при тестовом моделированиидвойного графенового слоя размером 5х5 нм2 в вакууме в течение 1 нс, ввакууме с одной молекулой GM, 1 нс, а также в воде, 10 нс, с обоимисиловыми полями.

В результате не было замечено каких-либо артефактов, ибыл приготовлен слой графена размерами 50х15 нм, такие размеры былиподобраны для моделирования адсорбции молекулы фибриногена а такжедля изучения адсорбции GM и образования слоя из молекул на поверхностиграфита .2.3.3 Параметризация для молекулы GM.Молекула GM имеет следующую структуру: (CH2)n(NCH2CO)mNH2[76].GM представляет собой алкан, на концах которого находятсяполиглицины (Рис. 2.7). Для создания молекулы были использованыРисунок 2.7 Молекула GM71параметры изсилового поля OPLS, для атомов были подобраны уже существующиеаналоги. Данные о длинах связей и углах были взяты из справочников [77].Для проверки стабильности получившейся молекулы ансамбль из 9 молекулмоделировался в течение 10 нс в воде, а затем, после портированиятопологии в силовое поле AMBER, дополнительно 5 нс.Атомы в алканной цепи имели следующие OPLS типы: opls_127 дляазота, opls_244 для крайнего углерода, opls_136 для внутренних углеродов,opls_140 для водородов при углероде, opls_241 для водородов при азоте.Параметризация для глицина осталась неизмененной.Парциальные заряды атомов таковы:-0.5 на N0.08 на концевых С-0.12 на внутренних С0.06 на Н при С0.3 на Н при NСуммарно молекула имеет заряд +2 е.

Дополнительная параметризациядля OPLS не вводилась, так как типы атомов подбирались таким образом,чтобы соответствовать длинам связей и углам между атомами в молекулеGM из справочников [77].Молекула была сконструирована в программе ArgusLab [78] , быливведены следующие длины связей между атомами:NC0.13350 ; между азотом и углеродом глицинаNCN0.14490; между азотом и концевым атомом алкана72CNCC0.15260; между атомами алканаРезультат моделирования GM в воде после 10 нс представлен на Рис.2.8. Видно, что 6 из 9 молекул образовали димеры, подтверждаяэкспериментальные данные по светорассеянию о димеризации GMвводе[76].

На поверхности графита GM образует плотную пленку, структуракоторой до сегодняшнего для не была хорошо изучена. Поэтому само по себемоделированиепроцессаадсорбцииGMнаповерхностьграфитапредставляет научный интерес.Процесс получения покрытого GM графита имеет следующие стадии:Рисунок 2.8 Молекулы GM после 10 нс моделирования в воде1) Получение равновесных конформаций ансамбля молекул GM в воде2) Сборка большого объема воды с молекулами GM и уравновешиваниесистемы.3) Присоединение к полученной системе графитовой подложки.4) Моделирование адсорбции имеющихся в системе GM на графит5)УдалениеводыидобавлениеУравновешивание системы.6) Повторение пунктов 4 и 5.73новыхGM.Добавлениеводы.Было проведено моделирование адсорбции 100 молекул GM на графитв воде.