Диссертация (Атомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы E.coli), страница 13

Построенная модель “кофейных чашек” объясняет полиморфизм ипути формирования того или иного типа наблюдаемых агрегатов белка.Основные выводы работы:1) Впервые показана способность σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coli кспонтанномуобразованиюамилоидоподобныхагрегатовinvitro.Продемонстрирована фибриллярная форма агрегатов диаметром 5,4 ± 0,2 нм,длиной до 300 нм и левозакрученной спиральностью с шагом витка ~ 20 нм.2) Показана сложная зависимость интенсивности палочкообразной агрегации отионной силы: возрастание в диапазоне концентрации NaCl 0-40 мM идальнейший спад в диапазоне 40-200 мM NaCl.943) Определены биотехнологически важные аспекты агрегации σ70-субъединицы,такие как использование частично лишённых N-конца мутантных вариантовбелка и определённого ионного состава.

Продемонстрирована роль Nконцевого домена белка как фактора, препятствующего интенсивной агрегациибелка.4) Определённые из АСМ-изображений значения модуля Юнга червеобразныхагрегатов σ70-субъединицы (4,1 – 6,5 МПа) говорят в пользу их неамилоиднойприроды.5) Обнаружен полиморфизм агрегатов белка σ70-субъединицы: палочкообразныхамилоидных фибрилл и червеобразных неамилоидных “бусин на нити”.Построена модель “кофейных чашек”, объясняющая полиморфизм и путиформирования того или иного типа наблюдаемых агрегатов белка.95БлагодарностиВыражаю глубокую благодарность моим научным руководителям: РуугеЭнно Куставичу за поддержку и руководство в ходе выполнения работы, иДубровину Евгению Владимировичу за обучение навыкам работы с атомносиловым микроскопом, всестороннюю помощь, поддержку и руководство в ходерешения поставленных задач.Выражаю признательность Друце Валерию Львовичу и Королевой ОльгеНиколаевнезадополнительныепредоставленныерезультатыпопрепаратыбелкаокрашиваниюибелкаегоКонгомутантов,закраснымиэлектрофорезу, сделавшие работу более цельной и осмысленной, и за ценныеконсультации и вдохновение на достижение намеченной цели.Благодарю:Толстову Анну Павловну за результаты по моделированию взаимодействиямономеров и димеров белка, а также участие в построении модели агрегации потипу “бусин на нити”.Абрамчука Сергея Савельевича и Корнеева Дениса Владимировича запроведенные эксперименты с применением просвечивающей электронноймикроскопией.сотрудников кафедры биофизики физического факультета МГУ имениМ.В.Ломоносова за теплую атмосферу, приобретенные ценные знания и навыки, атакже за необходимую критику.96Список литературы[1] Е.С.Северин.

Биохимия: учебник / Е.С. Северин, ГЭОТАР-Медиа, 2005.[2] P. Sadhale, J. Verma, A. Naorem. Basal transcription machinery: role in regulationof stress response in eukaryotes // J. Biosci., - 2007, - Vol. 32, - P. 569–578.[3] P.H. von Hippel, D.G. Bear, W.D. Morgan, J.A. McSwiggen. Protein-nucleic acidinteractions in transcription: a molecular analysis // Annu.

Rev. Biochem.,- 1984, Vol. 53, - P. 389–446.[4] T.M. Gruber, C.A. Gross. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterialtranscription space // Annu. Rev. Microbiol., - 2003, - Vol. 57, - P. 441–466.[5] R.R. Burgess, L. Anthony. How sigma docks to RNA polymerase and what sigmadoes // Curr. Opin. Microbiol., - 2001, - Vol. 4, - P.

126–131.[6] A. Malhotra, E. Severinova, S.A. Darst. Crystal Structure of a σ70 SubunitFragment from E. coli RNA Polymerase // Cell, - 1996, - Vol. 87, - P. 127–136.[7] J.D. Helmann, M.J. Chamberlin. Structure and function of bacterial sigma factors //Annu. Rev. Biochem., - 1988, - Vol. 57, - P. 839–872.[8] E. Severinova, K. Severinov, D. Fenyo, M. Marr, E.N. Brody, J.W.

Roberts, B.T.Chait, S.A. Darst. Domain organization of the Escherichia coli RNA polymerasesigma(70) subunit // J. Mol. Biol., - 1996, - Vol. 263, - P. 637–647.[9] Peter A. Lowe, Ueli Aebi, Carol Gross, Richard R. Burgess. In Vitro ThermalInactivation of a Temperature-sensitive σ Subunit Mutant (rpoD8OO) of Escherichiacoli RNA Polymerase Proceeds by Aggregation // J.

of Biological Chemistry, 1981, - Vol. 256, - P. 2010–2015.[10] A.L. Ferguson, A.D. Hughes, U. Tufail, C.G. Baumann, D.J. Scott, J.G. Hoggett.Interaction of σ70 with Escherichia coli RNA polymerase core enzyme studied bysurface plasmon resonance // FEBS Lett., - 2000, - Vol. 481, - P. 281–284.[11] S. Callaci, E. Heyduk, T. Heyduk. Conformational changes of Escherichia coliRNA polymerase sigma70 factor induced by binding to the core enzyme // J. Biol.Chem., - 1998, - Vol. 273, - P. 32995–33001.97[12] J. Adamcik, R. Mezzenga. Proteins Fibrils from a Polymer Physics Perspective //Macromolecules, - 2012, - Vol.

45, - P. 1137–1150.[13] R.A. Kyle. Amyloidosis: a convoluted story // Br. J. Haematol., - 2001, - Vol.114, - P. 529–538.[14] J.D. Sipe, A.S. Cohen. Review: history of the amyloid fibril // J. Struct. Biol., 2000, - Vol. 130, - P. 88–98.[15] C.-Y. Lin, T. Gurlo, R. Kayed, A.E. Butler, L.

Haataja, C.G. Glabe, P.C. Butler.Toxic human islet amyloid polypeptide (h-IAPP) oligomers are intracellular, andvaccination to induce anti-toxic oligomer antibodies does not prevent h-IAPPinduced beta-cell apoptosis in h-IAPP transgenic mice // Diabetes, - 2007, - Vol. 56,- P. 1324–1332.[16] M. Faendrich.

On the structural definition of amyloid fibrils and otherpolypeptide aggregates // Cell. Mol. Life Sci., - 2007, - Vol. 64, - P. 2066–2078.[17] P.K. Chiang, M.A. Lam, Y. Luo. The many faces of amyloid beta in Alzheimer’sdisease // Curr. Mol. Med., - 2008, - Vol. 8, - P. 580–584.[18] M. Sunde, L.C. Serpell, M. Bartlam, P.E. Fraser, M.B.

Pepys, C.C.F. Blake.Common core structure of amyloid fibrils by synchrotron X-ray diffraction // J. Mol.Biol., - 1997, - Vol. 273, - P. 729–739.[19] R. Nelson, M.R. Sawaya, M. Balbirnie, A.O. Madsen, C. Riekel, R. Grothe, D.Eisenberg. Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils // Nature, - 2005,- Vol. 435, P. 773–778.[20] T. Luhrs, C.

Ritter, M. Adrian, D. Riek-Loher, B. Bohrmann, H. Doeli, D.Schubert, R. Riek. 3D structure of Alzheimer’s amyloid-beta (1-42) fibrils // Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A., - 2005, - Vol. 102, P. 17342–17347.[21] W. Klunk, J. Pettegrew, D. Abraham. 2 Simple Methods for Quantifying LowAffinity Dye Substrate Binding // J. Histochem. Cytochem., - 1989, - Vol. 37, - P.1293–1297.[22] L. Millucci, R. Raggiaschi, D. Franceschini, G. Terstappen, A. Santucci.

Rapidaggregation and assembly in aqueous solution of A beta (25-35) peptide // J. Biosci.,- 2009, - Vol. 34, - P. 293–303.98[23] M.B. Podlisny, B.L. Ostaszewski, S.L. Squazzo, E.H. Koo, R.E. Rydell, D.B.Teplow, D.J. Selkoe. Aggregation of secreted amyloid beta-protein into sodiumdodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture // J. Biol. Chem., - 1995, - Vol. 270, P. 9564–9570.[24] B.H. Toyama, J.S. Weissman. Amyloid structure: conformational diversity andconsequences // Annu. Rev. Biochem., - 2011, - Vol.

80, - P. 557–585.[25] C.M. Dobson. Protein misfolding, evolution and disease // Trends Biochem. Sci.,- 1999, - Vol. 24, - P. 329–332.[26] F. Chiti, C.M. Dobson. Protein misfolding, functional amyloid, and humandisease // Annu. Rev. Biochem., - 2006, - P. 333–366.[27] S.G. Bolder, H. Hendrickx, L.M.C. Sagis, E. van der Linden. Fibril assemblies inaqueous whey protein mixtures // J. Agric. Food Chem., - 2006, - Vol. 54, - P.

4229–4234.[28] J. Goers, S.E. Permyakov, E.A. Permyakov, V.N. Uversky, A.L. Fink.Conformational prerequisites for alpha-lactalbumin fibrillation // Biochemistry(Mosc.), - 2002, - Vol. 41, - P. 12546–12551.[29] J. Adamcik, J.-M. Jung, J. Flakowski, P. De Los Rios, G. Dietler, R. Mezzenga.Understanding amyloid aggregation by statistical analysis of atomic forcemicroscopy images // Nat. Nanotechnol., - 2010, - Vol. 5, - P.

423–428.[30] L.N. Arnaudov, R. de Vries. Strong impact of ionic strength on the kinetics offibrilar aggregation of bovine beta-lactoglobulin // Biomacromolecules,- 2006, - Vol.7, - P. 3490–3498.[31] S.M. Loveday, X.L. Wang, M.A. Rao, S.G. Anema, H. Singh. β-Lactoglobulinnanofibrils: Effect of temperature on fibril formation kinetics, fibril morphology andthe rheological properties of fibril dispersions // Food Hydrocoll., - 2012, - Vol. 27, P. 242–249.[32] C.

Lara, S. Gourdin-Bertin, J. Adamcik, S. Bolisetty, R. Mezzenga. SelfAssembly of Ovalbumin into Amyloid and Non-Amyloid Fibrils //Biomacromolecules, - 2012, - Vol. 13, - P. 4213–4221.99[33] C. Veerman, G. de Schiffart, L.M.C. Sagis, E. van der Linden. Irreversible selfassembly of ovalbumin into fibrils and the resulting network rheology // Int. J. Biol.Macromol., - 2003, - Vol. 33, - P. 121–127.[34] F.G. Pearce, S.H. Mackintosh, J.A. Gerrard.

Formation of amyloid-like fibrils byovalbumin and related proteins under conditions relevant to food processing // J.Agric. Food Chem., - 2007, - Vol. 55, - P. 318–322.[35] C. Lara, I. Usov, J. Adamcik, R. Mezzenga. Sub-Persistence-Length ComplexScaling Behavior in Lysozyme Amyloid Fibrils // Phys. Rev. Lett., - 2011, - Vol.107, - P.

238101.[36] E. Frare, P. Polverino De Laureto, J. Zurdo, C.M. Dobson, A. Fontana. A highlyamyloidogenic region of hen lysozyme // J. Mol. Biol., - 2004, - Vol. 340, - P. 1153–1165.[37] L.N. Arnaudov, R. de Vries. Thermally Induced Fibrillar Aggregation of Hen EggWhite Lysozyme // Biophys. J., - 2005, - Vol. 88, - P. 515–526.[38] M. Fändrich, M.A.

Fletcher, C.M. Dobson. Amyloid fibrils from musclemyoglobin // Nature, - 2001, - Vol. 410, - P. 165–166.[39] A. Arora, C. Ha, C.B. Park. Insulin amyloid fibrillation at above 100 degrees C:new insights into protein folding under extreme temperatures // Protein Sci. Publ.Protein Soc., - 2004, - Vol. 13, - P. 2429–2436.[40] T.P.J. Knowles, M.J. Buehler. Nanomechanics of functional and pathologicalamyloid materials // Nat.

Nanotechnol., - 2011, - Vol. 6, - P. 469–479.[41] M. Reches, E. Gazit. Molecular Self-Assembly of Peptide Nanostructures:Mechanism of Association and Potential Uses // Curr. Nanosci., - 2006, - Vol. 2, - P.105–111.[42] T.P.J. Knowles, T.W. Oppenheim, A.K. Buell, D.Y. Chirgadze, M.E. Welland.Nanostructured films from hierarchical self-assembly of amyloidogenic proteins //Nat.

Nanotechnol., - 2010, - Vol. 5, - P. 204–207.[43] S. Barrau, F. Zhang, A. Herland, W. Mammo, M. R. Andersson and O. Inganäs.Integration of amyloid nanowires in organic solar cells // Appl. Phys. Lett., - 2008, Vol. 93, - P. 023307.100[44] K.J. Channon, G.L. Devlin, C.E. MacPhee. Efficient Energy Transfer within SelfAssembling Peptide Fibers: A Route to Light-Harvesting Nanomaterials // J. Am.Chem.