Диссертация (Атомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы E.coli)

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГОПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ«МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имениМ.В.ЛОМОНОСОВА»ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТНа правах рукописиКузьмина Наталья ВикторовнаАтомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицыРНК-полимеразы E.coliСпециальность 03.01.02 - «Биофизика», 03.01.08 - «Биоинженерия»ДиссертацияНа соискание ученой степени кандидата физико-математических наукНаучные руководители:доктор физико-математических наук,Рууге Э.К.кандидат физико-математических наук,Дубровин Е.В.Москва, 2017 г.ОглавлениеСписок использованных сокращений ........................................................................... 4Введение ...........................................................................................................................

5Глава 1. Литературный обзор ...................................................................................... 141.1. РНК-полимераза. σ-субъединица....................................................................... 141.2. Агрегация белков. Амилоид ............................................................................... 161.3. Методы исследования амилоидных структур с высоким пространственнымразрешением................................................................................................................

261.4. Применение АСМ для исследования полиморфизма амилоидов .................. 38Глава 2. Исследование палочкообразной агрегации σ70-субъединицы РНКполимеразы E. coli ......................................................................................................... 452.1. Материалы и методы ........................................................................................... 452.2. Спонтанная агрегация σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coli ................ 472.3. Специфическое окрашивание Конго красным. Электрофорез.

...................... 572.4. Влияние N-концевого домена на способность к агрегации σ70-субъединицыРНК-полимеразы ........................................................................................................ 602.5. Влияние солевого окружения на способность к агрегации σ70-субъединицыРНК-полимеразы и ее мутантов ................................................................................ 642.6. Просвечивающая электронная микроскопия ...................................................

692.7. Деполяризованное динамическое рассеяние света (ДДРС) ............................ 71Глава 3. Исследование червеобразной агрегации σ70-субъединицы РНКполимеразы E. coli ......................................................................................................... 763.1. Атомно-силовая микроскопия и механические свойства интремедиатов.Персистентная длина. Модуль Юнга. ......................................................................

763.2. Моделирование σ70-субъединицы методом молекулярной динамики........... 83Глава 4. Иерархическая модель агрегации амилоидных белков ............................. 8724.1. Модель “кофейных чашек” ................................................................................ 87Заключение и выводы ...................................................................................................

93Благодарности ................................................................................................................ 96Список литературы ....................................................................................................... 973Список использованных сокращенийАСМ – атомно-силовая микроскопия или атомно-силовой микроскопВОПГ – высокоориентированный пиролитический графитРНК – рибонуклеиновая кислотаДНК – дезоксирибонуклеиновая кислотаДДРС – деполяризованное динамическое рассеяние светаДСН – додецилсульфат натрияМД – молекулярная динамикаПААГ – полиакриламидный гельПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия или просвечивающийэлектронный микроскопФВК – фосфорновольфрамовая кислотаЯМР – ядерный магнитный резонанс4ВведениеПроцесс транскрипции в клетках живых организмов представляет собойсинтез РНК с использованием ДНК в качестве матрицы.

Перенос генетическойинформации с ДНК на РНК катализируется ферментом ДНК-зависимой РНКполимеразой. В процессе транскрипции выделяют стадии инициации, элонгации итерминации. Инициация транскрипции представляет собой сложный процесс,зависящий от наличия или отсутствия различных белков (так, у Escherichia coliидентифицировано более 100 белков, тем или иным способом влияющих на РНКполимеразу).У эукариот и прокариот РНК-полимеразы различаются по своей структуре.В прокариотических клетках этот фермент состоит из нескольких субъединиц:альфа-, бета- и сигма-субъединиц.

Сигма-субъединица отвечает за инициациютранскрипции, поэтому играет важную роль в генетической экспрессии.В настоящее время для исследования свойств биологических объектовшироко применяется метод атомно-силовой микроскопии, позволяющий получатьтопографические изображения с наноразмерным разрешением, исследоватьмеханические,магнитные,электрическиеидругиесвойстваобъектов,производить наноманипуляции. Метод позволяет проводить исследования вжидкости, что чрезвычайно важно для сохранения нативной среды биологическихобъектов и приближения условий эксперимента к реальности.σ70-субъединицаРНК-полимеразыявляетсявнастоящиймоментединственной не полностью закристаллизованной субъединицей РНК-полимеразыEscherichia coli, что осложняет изучение её структуры и функций.

Поэтомуизучение данного белка прямыми методами с высоким пространственнымразрешением может дать ценную информацию об особенностях строения ифункционирования этой молекулы.Актуальность исследования5Процесс транскрипции в экспрессии генетического материала живыхорганизмов катализируется РНК-полимеразой и характеризуется сложнымвзаимодействием фермента с ДНК и различными белками. Инициациятранскрипции прокариот происходит после присоединения к РНК-полимеразебелкаσ-факторатранскрипцию(σ-субъединицы).генов,σ70-субъединицаконтролирующихиE.coliобеспечиваетобслуживающихосновныевнутриклеточные процессы.

За последние несколько лет собрано много данных оструктуре и функции σ70-субъединицы, в частности, получены структурыотдельных функциональных доменов. В некоторых работах упоминается обобразовании агрегатов σ70-субъединицы и ее мутантов, однако без уточненияморфологии и свойств агрегатов.Многие белки склонны к формированию агрегатов, особый интерес средикоторых вызывают амилоиды.

Структурно амилоиды характеризуются большимсодержаниемβ-складок,морфологическинаиболеечастовстречаетсяфибриллярная форма, также отмечаются червеобразные и спиралевидныеструктуры. Кроме этого, характерными признаками амилоидов являютсяспецифическое взаимодействие с красителем Конго красный, вызывающеекрасное смещение в спектре адсорбции с 490 нм на 530-540 нм, специфическоесвязывание с тиофлавином Т и нерастворимость в большинстве растворителей (вчастности, в додецилсульфате натрия). Амилоиды на протяжении уже несколькихдесятилетий являются предметом разносторонних исследований и дискуссий.Наиболеечастовстречаемыеслучаиамилоиднойагрегациисвязаныcзаболеваниями человека, такими как нейродегенеративные болезни Альцгеймера,Паркинсона, Хантингтона; диабет второго типа и др.

Однако в последние годыстало ясно, что при определенных условиях амилоидную форму могут иметь чутьли не все белки. Хотя амилоиды могут вырасти из различных по своим функциями структуре белков, тем не менее, все они имеют много общего: амилоидыустойчивы к воздействию денатурирующих агентов и протеаз, имеются данные обих способности к самосборке и стабильности при высоких температурах (вплотьдо 140˚С).

В связи с выдающимися механическими свойствами амилоидных6фибриллпредлагаютсяиспользования:различныесозданиебиоинженерныенаноструктурированныхнаправленияпленоксихпрочностью,сравнимой с прочностью шелка; использование амилоидных фибрилл в качествеориентирующей матрицы для органических солнечных элементов; создание на ихоснове электрической нанопроволоки посредством нанесения наночастиц золотаи многое другое.Работ по систематическому исследованию агрегации σ70-субъединицы ранеене проводилось.

Установление амилоидной природы и описание морфологии исвойств агрегатов σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coliпомогутприблизитьсяамилоидныхфибрилл,кпониманиюпосколькурегуляцииихи ее мутантовпроцессафактическаяформированиясамоорганизацияконтролируется сложным взаимодействием физических и химических факторов.Механизм агрегации, движущая сила и молекулярные основы физических свойствамилоидных фибрилл являются актуальными задачами на сегодняшний день,решение которых приведёт к созданию новых возможностей для применения вмедицине и технологии.Цель и задачи исследованияЦель работы: выявление физико-химических характеристик агрегации σ70субъединицы РНК-полимеразы E.

сoli.В этой связи основными задачами работы являлись:1) Исследование морфологии агрегатов белка σ70-субъединицы РНКполимеразы E. сoli методом атомно-силовой микроскопии и сравнение сданными литературы, касающимися морфологии агрегатов другихбелков.2) Исследование зависимости интенсивности агрегации σ70-субъединицыРНК-полимеразы E. сoli от времени хранения белка и ионной силыраствора.73) Исследование агрегации мутантных вариантов σ70-субъединицы РНКполимеразы E. сoli для выяснения роли различных участков белка вагрегации.4) Выявление биотехнологически значимых аспектов агрегации σ70субъединицыРНК-полимеразысoli,E.благоприятствующихинтенсивному формированию агрегатов.5) Анализ механических свойств червеобразных агрегатов σ70-субъединицыРНК-полимеразы E.

сoli.6) Построение модели агрегации σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. сoli.Научная новизна исследования1) Впервые обнаружена амилоидная палочкообразная агрегация σ70субъединицыРНК-полимеразыE.сoliиопределеныусловия,благоприятствующие интенсивному формированию агрегатов.2) Впервые охарактеризованы трёхмерная морфология и физическиесвойства агрегатов σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. сoli.3) Впервые изучено влияние N-концевого участка σ70-субъединицы РНКполимеразы E.