Диссертация (1102290), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Содержание палочкообразных агрегатов длямутанта D2 составило 7%, для D4 способность к фибриллообразованию оказаласьсредней, содержание агрегатов составило 29%.В распределении агрегатов мутантных вариантов σ70 (рисунок 2.14) подлинам наблюдаются пики при значениях около 100 нм, что согласуется сданными по σ70-субъединице дикого типа. Однако значительно отличаетсякартина на правой части распределения, которая заметно больше (до 450 нм) длямутантов D1 и D4.
Наличие более длинных фибрилл D1 и D4 по сравнению сдлинами агрегатов белка дикого типа может означать повышенный уровень ростафибрилл.Поскольку частично разупорядоченные участки внутри белка считаютсяпредпосылками к образованию амилоидов [101], частичная делеция участка 1.1(мутанты D1 и D4), по-видимому, ведет к дополнительному разворачиваниюмономера белка и обеспечивает более выгодные стерические условия для62Число палочкообразных агрегатовЧисло палочкообразных агрегатовДлина палочкообразных агрегатов (нм)Число палочкообразных агрегатовДлина палочкообразных агрегатов (нм)Длина палочкообразных агрегатов (нм)Рисунок 2.14.
АСМ-изображения (слева) и гистограммы распределения по длинампалочкообразных агрегатов (справа), образованных мутантами D1 (a), D2 (b) и D4 (c) σ70субъединицы РНК-полимеразы E. coli. Раствор с мутантными белками, нанесенный на слюду,содержал 20мМ NaCl, 5мМ MgSО4.63агрегации. Повышение способности к образованию фибрилл в случае мутантовD1иD4такжеможетбытьобъясненоэкспонированиемнекоторыхамилоидогенных участков, которые обычно спрятаны и экранированы в σ 70субъединице дикого типа. Ярко выраженный эффект возрастания числапалочкообразных агрегатов для мутанта D1 показывает, что удаленный участок(1-73) может функционировать как локальный шаперон, защищающий белок отинтенсивной агрегации.
Совсем недавно подобный эффект был описан длярибонуклеазы А [102]. В случае мутанта D2, по-видимому, наблюдаемый низкийуровень агрегации происходит при участии других сайтов, возникающих врезультате локальных структурных изменений.2.5. Влияние солевого окружения на способность к агрегации σ70субъединицы РНК-полимеразы и ее мутантовНа следующем шаге была исследована способность σ70-субъединицы и еемутантов к образованию агрегатов в различном солевом окружении.
Для этихцелей были проведены эксперименты с образцами, полученными из растворов 0200 мM NaCl (для всех трех мутантных белков) и 0-50 мM MgSO4 (для мутантаD1).Все три типа мутанта σ70 показали низкую способность к агрегации в оченьслабом ионном окружении. Малое количество адсорбированных на поверхностьслюды палочкообразных агрегатов можно было бы интерпретировать и подругому, принимая во внимание отрицательный заряд агрегатов σ70, которыеотталкиваются от отрицательно заряженной поверхности слюды, что объяснялобы низкий уровень адсорбции [88].
Исходя из этого, можно было бы ожидатьзаметное увеличение числа агрегатов при увеличении концентрации электролита.Однако поведение адсорбции агрегатов σ70-субъединицы в экспериментахоказалосьнемонотонным.Нарисунке2.15представленоколичествоадсорбированных палочкообразных агрегатов, нормированное на 1 мкм 2, какфункции концентрации NaCl (a) и MgSO4 (b) в растворе.64Поверхностная плотностьКонцентрация NaCl, мМадсорбции агрегатов, мкм-2-2адсорбции агрегатов, мкмПоверхностная плотностьabКонцентрация MgSO4, мМРисунок 2.15. Плотность адсорбции палочкообразных агрегатов σ70-субъединицы дикоготипа и ее мутантных вариантов D1, D2, D4 как функция концентрации NaCl и MgSO4.На графиках видно, что все варианты мутантного белка имеют сходнуютенденцию: поначалу адсорбция увеличивается до максимального значения приконцентрации 20-40 мM NaCl, затем количество агрегатов спадает (рисунок 2.15a). При критически низком содержании электролита способность к агрегации σ70субъединицы и ее мутантов оказалась практически нулевой, что можно объяснитьэлектростатическим отталкиванием мономеров белка (суммарно имеющегоотрицательный заряд).
При умеренном содержании соли (концентрация NaCl 2040 мM) электростатическое отталкивание уменьшается вследствие Дебаевскойэкранировки, и становится возможным близкий контакт мономеров белка, чтоприводит к увеличению вероятности агрегации. При дальнейшем увеличенииионнойсилыстановитсяболеевероятнымкомпактноесостояниеσ70-субъединицы. Поэтому наблюдается понижение способности белка к агрегациипри концентрации NaCl 100-200 мM. Повышение концентрации двухвалентныхионов электролита приводит к умеренному увеличению адсорбции агрегатов σ70субъединицы, насыщения при этом не наблюдается (рисунок 2.10 b).
Роль MgSО4может заключаться в дополнительной стабилизации уже образованных агрегатовσ70-субъединицы [103].Более того, подобная картина с небольшим числом палочкообразных65агрегатов σ70 в отсутствие солей наблюдалась при нанесении раствора с белком наэлектростатически нейтральный высокоориентированный пиролитический графит(ВОПГ). Это позволяет полагать, что полученная статистика образованияпалочкообразных агрегатов при различном солевом окружении отражаетспособность белка к агрегации, присущую самому белку, и не связанаэлектростатическим взаимодействием агрегатов с поверхности слюды (рисунок2.16).Рисунок 2.16. АСМ-изображения σ70-субъединицы РНК-полимеразы E.
coli, нанесеннойна поверхность ВОПГ из водного раствора. Вставки демонстрируют увеличенный участок. Внижнем правом углу представлен профиль поперечного сечения фибриллы. Диаметр позначению совпадает (в пределах погрешности) с полученной из экспериментов на слюдевеличиной.66Типичные АСМ-изображения, демонстрирующие агрегацию мутантных σ70субъединиц при различной концентрации NaCl, представлены на рисунке 2.17(концентрация MgSO4 была фиксирована и равна 5 мM). Наблюдение агрегацииσ70-субъединицы при концентрациях электролитов, близких к физиологическим(100 мM NaCl, 5-10 мM MgSО4) (рисунок 2.17 j-o), является особо важным,поскольку может иметь биологическую значимость.Несмотря на широко распространенную практику АСМ-сканированиябелков на воздухе, подтверждение полученных результатов в водной средеявляется существенно важным, так как позволяет исключить эффекты, связанныес высушиванием белка.АСМ-изображения белка, исследованного в водном растворе, представленына рисунке 2.18.Рисунок 2.18.
(a) АСМ-изображение и (b) монтаж АСМ-изображений мутанта D2 σ70субъединицы. Сканирование в растворе 40 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4. (c) Поперечное сечениеагрегата вдоль пунктира в (b).Диаметр (высота) фибрилл D2-мутанта согласно данным АСМ в жидкостиоказался равным 6,2 ± 0,6 нм, что немного больше значения, полученного навоздухе (5,4 ± 0,2 нм). Это может объясняться слабой усадкой агрегатов впроцессе высыхания.
Что касается распределения агрегатов по длинам, пикпришелся на 175 нм, а хвост наблюдался плоть до 1,3 мкм (рисунок 2.19). Близкие67Рисунок 2.17. АСМ-изображения мутантных белков D1 (слева), D2 (в середине) и D4(справа), нанесенных на поверхность слюды из раствора, содержащего 0 (а-с), 20 (d-f), 40 (g-i),100 (j-l), 200 (m-o) мМ NaCl. Концентрация MgSO4 составляла 0 мМ (a-c) 5 мМ (d-o).68морфология и размеры агрегатов, полученные при АСМ-исследовании σ70субъединицы в водном растворе и на воздухе, свидетельствует об отсутствиизначительного влияния процесса высушивания образца на морфологию исвойства палочкообразных агрегатов. Это, в свою очередь, свидетельствует означимостирезультатовАСМ-исследованийагрегатовσ70-субъединицы,Количествопалочкообразных агрегатовполученных в воздушной среде.Длина, нмРисунок 2.19.
Распределение по длинам палочкообразных агрегатов, измеренных поданным АСМ-сканирования в растворе 40 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4.2.6. Просвечивающая электронная микроскопияПримеры ПЭМ-изображений дикого и мутантного типов σ70-субъединицыпредставлены на рисунках 2.20 и 2.21. На изображениях наблюдаютсяпалочкообразные фибриллы. В отличие от АСМ, разрешения ПЭМ оказалосьнедостаточно для визуализации спиральной структуры фибрилл.
Это может бытьсвязано с методикой пробоподготовки контрастированием солями тяжелыхметаллов. Кроме того, визуализации спиральной структуры с помощью АСМможет способствовать небольшая сила воздействия кантилевера на образец,69благодаря которой участки с разной жёсткостью (виток белковой спирали иобласть между этими витками) деформируется по-разному, создавая контраст визображении. Средний диаметр измеренных по ПЭМ-данным фибрилл дикоготипа белка оказался равным 6,0 ± 1,0 нм (что неплохо согласуется с даннымиАСМ), а разброс длин фибрилл белка оказался в диапазоне от 200 до 570 нм.Рисунок 2.20.
Типичные ПЭМ-изображения дикого типа σ70-субъединицы. Негативноеконтрастирование ФВК, снимки выполнены Абрамчуком С.С.70abcdРисунок 2.21. ПЭМ-изображения мутанта σ70-субъединицы с заменой His180 на Thr180(a,b,c) и мутанта с заменой His242 на Glu242 (d). Негативное контрастирование (уранилацетат),снимки выполнены Корнеевым Д.В.2.7. Деполяризованное динамическое рассеяние света (ДДРС)Деполяризованное динамическое рассеяние света является эффективнымметодом исследования асимметричных, анизотропных и поляризуемых частиц в71растворе.
В частности, методсебяужезарекомендовал для изученияпалочкообразных структур [104,105].Эксперименты ДДРС были проведены совместно с Лаптинской Т. В. наприбореCorrelatorGoniometerSystemALV-CGS-5000/6010(Германия),оснащенном He-Ne-лазером длиной волны 633 нм и мощностью 20 мВт. Дляизмерений рассеяния деполяризованного света перед детектором устанавливаласьпризма Глана-Томпсона. Стеклянная кювета с раствором белка (внутреннимдиаметром 0,8 см) погружалась в ванну с толуолом во избежание отражения отстенок кюветы. Время измерения функций корреляций составило 20 минут.Математическая обработка была проведена с использованием обратногопреобразования Лапласа (с помощью программного пакета CONTIN [106]).Для оценки длины (2a) и диаметра (2b) палочкообразных частиц в раствореиспользовались следующие уравнения, пригодные для анизотропных жесткихцилиндрических объектов [104]: = = 2+ ln 2 − 1][ln6 2 2( ) (ln ( ))3 [] 22 28 3+ ln 2 − 1) + 0,651 (ln ( ))( ) (ln(2.1)(2.2)где kB – константа Больцмана, T – абсолютная температура, - вязкостьрастворителя, а Dt и Dr – трансляционный и вращательный коэффициентдиффузии, соответственно, связанные с коэффициентами релаксации (Г = 1/τ)динамического рассеяния поляризованного (ГVV) и деполяризованного (ГVH) светаследующими соотношениями [107]:72Г = 2(2.3)Г = 2 + 6(2.4)где q = 4πn sin(β/2)/λ0 – вектор волнового рассеяния, а β – угол рассеяния(40° в наших экспериментах).Для исследования палочкообразных агрегатов σ70-субъединицы в раствореметодом ДДРС был выбран мутант D4 (делеция 74-100 от N-конца), который,согласно данным АСМ, давал большее количество таких структур по сравнению сдиким типом белка.Функцииавтокорреляцииинтенсивностиполяризованного(VV)идеполяризованного (VH) света g2(τ) σ70-субъединицы концентрацией 0,1 мг/мл,измеренные при угле рассеяния θ=40° (q = 4πn sin(β/2)/λ0 ≈ 9,05 мкм-1, где n –коэффициент преломления растворителя, λ0 – длина волны падающего источникасвета), представлена на рисунке 2.22.Рисунок 2.22.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
