Диссертация (1102290), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Формирование зондазавершается, когда небольшой оксидный кусочек падает с вершины. В29дальнейшем с целью защиты структуры зонда верхняя и нижняя частипротравленного кантилевера покрываются Si3N4.Для кремниевых кантилеверов при описанном методе изготовлениявозможно добиться радиуса кривизны на кончике иглы вплоть до 10 нм. Дляреализации меньшей величины радиуса кривизны используют методикунаращивания углеродных нанотрубок на конце иглы, или же более острыекантилеверы получают методом осаждения, индуцированного электроннымпучком.
Во втором случае камеру электронного микроскопа наполняютуглеродсодержащим газом и фокусируют электронный пучок на зонд. Врезультате интенсивной бомбардировки электронами, газ у зонда разлагается иформирует кончик иглы с высоким аспектным соотношением. Таким образом,остроту кантилеверов можно улучшить до 1 нм.За прошедшие годы применение АСМ позволило достичь уникальныхнаучных результатов в различных областях физики, химии и биологии.Возможности данного метода по сравнению с другими делают особенноперспективным применение АСМ для изучения биологических материалов. ДНК,РНК, вирусы, ферменты, белки и их комплексы являются подходящимматериалом для атомно-силовой микроскопии. АСМ обеспечивает возможностьизучения объектов в водной среде.
При этом нет необходимости в химическоймодификации биочастиц, эксперимент можно проводить без механическихповреждений, с возможностью визуализации в водной среде при физиологическисоответствующих температуре и pH, а также повторного сканирования образцапри различных условиях. Перечисленные факторы являются преимуществамиАСМ по сравнению с другими методами (кристаллографией, ЯМР и др.).Наиболее интересные закономерности поведения биокомплексов, такие какмоделиихсборки,динамическоеповедение[58,59]илиспособностьвзаимодействия с другими молекулами, можно проследить с помощью АСМ.В АСМ важным условием является достаточно сильная иммобилизацияобъекта на плоской поверхности.
Самым популярным и удобным материалом дляизготовления подложки, который обеспечивает надежное крепление биочастиц,30является мусковит (слюда). Минерал имеет кристаллическую структуру с общейформулойK[Si3Al]O10Al2(OH)2ипредставляетсэндвичизтонкихалюмокислородных слоев и двух кремниевых слоев.
В кремниевых слоях один изчетырех атомов кремния случайно замещен атомом алюминия и создает разницу взаряде, которая компенсируется ионами K+, расположенными в области междусоседними кремниевыми слоями (рисунок 1.13).Слюда наиболее подвержена скалыванию вдоль плоскости, содержащей K+.При контакте с молекулами воды гидратированные ионы калия могутдесорбировать, создавая отрицательный заряд на поверхности.бтетраэдрическийслой Al, 3Siоктаэдрическийслой Alтетраэдрическийслой Al, 3SiРисунок 1.13.
(a) Модель идеальной слюды с двумя слоями SiO2 над и подоктаэдрическим слоем AlO6. (б) Проекция (110) демонстрирует гидроксильные группы воктаэдрических слоях, а также ионы K+ в области между соседними кремниевыми слоями [60].Тонкие кристаллические пластины слюды легко скалываются механическимпутем, таким образом, можно получить чистую атомарно-ровную поверхность,которая имеет отрицательный заряд в водном растворе. Заряда и, в результате,электростатической силы оказывается достаточно, чтобы держать белковыекомплексы на месте, если при значении pH, близкому к нейтральному (чтосоответствует физиологической норме), белки заряжены положительно.
Есличастицаоказываетсязаряженаотрицательно,тослюдутакжеможноиспользовать, но предварительно необходимо обработать ее положительными31ионами, например Ni2+ или Zn2+. Кроме этого, важно отметить, что поверхностьслюды гидрофильна, и в обычных лабораторных условиях (с достаточнойвлажностью) на ней присутствует тонкий нанометровый слой воды, так что дажепри высушивании подложки с образцом биологические объекты остаются вчастично гидратированном состоянии [61]. Однако, стоит учитывать, что присканированиинавоздухевертикальныеразмерыобъектов(особеннобиологических, вследствие их мягкости) оказываются заниженными из-заприминания кантилевером.Стекло, графит или золото также используются в качестве подложек приработе с АСМ.
Результаты экспериментов имеют биологическую значимость присохранении функциональной активности объектов после адсорбции на подложку.Пример исследования процесса транскрипции на поверхности стекла и слюды ссохранением активности РНК-полимеразы E.
coli (рисунок 1.14) [62,63]иллюстрирует эффективность применения АСМ при работе с биологическимиобъектами на молекулярном уровне.Рисунок 1.14. АСМ-изображение транскрипционных комплексов на поверхности слюды,полученное после выдержки раствора с транскрипционным комплексом на поверхности слюды,высушивания и сканирования на воздухе. Стрелка указывает на связанную с транскриптоммолекулу РНК-полимеразы [62].32Среди важных и существенных особенностей АСМ следует назватьвозможность увидеть атомарную и молекулярную структуру поверхности,воздействовать на нее на уровне отдельных атомов и молекул – проводитьнаноманипуляции. Пространственное разрешение атомно-силового микроскопадостигает субнанометрового уровня в направлении по нормали к образцу инанометрового в плоскости образца. Таким образом, метод АСМ может датьобщую топографическую картину и позволяет изучать морфологию объектов сатомарным разрешением.Кроме этого, огромный пул приложений АСМ связан с его использованиемдля наноманипуляций объектами и измерения сил взаимодействия между ними.Посредствоммодификациизонда(например,ковалентнымпришиваниембиологических молекул) можно исследовать взаимодействия по типу рецепторлиганд, антиген-антитело, измерять силу адгезии, упругие и вязкоупругиесвойства объектов [64].С применением АСМ было показано, что многие глобулярные белки приопределенных условиях образуют амилоидоподобные фибриллы in vitro [65,66].Кроме этого, с помощью АСМ было исследовано множество амилоидныхструктур.
В работе по исследованию амилоида белка β25-35 (токсичного участкаβ-амилоидногопептида)[58]авторамибылопоказанокалий-зависимоеобразование треугольно ориентированных фибрилл на слюде (рисунок 1.15).Авторами высказана перспектива использования амилоидных фибрилл внанотехнологиях (например, при формировании ориентированных путей длямолекулярных устройств и создания наноэлектрических цепей) благодарявозможности искусственного синтеза субъединиц амилоидного пептида истабильности фибрилл под различного рода воздействиями.В работе [59] авторами проанализированы свойства молекулы β25-35_N27Cи обнаружено формирование эпитаксиально растущих фибрилл на слюде, изкоторых получаются треугольно ориентированные ветвящиеся структуры.Отмечается высокая чувствительность роста ориентированных структур33Рисунок 1.15.
АСМ-изображения треугольно-ориентированных фибрилл белка β25–35 наслюде [58].мутантного белка β25-35_N27C к катионной концентрации по сравнению с дикимтипом. Наноманипуляциями с помощью специальных кантилеверов авторыпоказали химическую активность и реактивность сульфгидрильной группыцистеина Cys27 белка, обращенного (при адсорбции белка на поверхность слюды)в раствор (рисунок 1.16).
С помощью специфического мечения Cys27,ориентированные структуры белка Aβ25-35_N27C предложены авторами киспользованиюдляконструированиянанобиотехнологическихустройств:наномеханических устройств (с прикреплением моторных белков), наносенсоров(с применением энзимов) или наноэлектрических цепей (с нанесением наночастицзолота).Использованиеатомно-силовоймикроскопиивбиологическихибиомедицинских исследованиях растет экспоненциально. Высокое разрешение ивозможность работать в жидкой среде являются ключевыми преимуществами приработе с биологическими объектами – как с отдельными молекулами, так ицелыми клетками.34Рисунок 1.16.
Наноманипуляции фибриллами белка Aβ25-35_N27C: до (a) и после (b).Черные и серые метки обозначают целевые места манипуляции [59].Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)Просвечивающая электронная микроскопия наравне с АСМ являетсямощным инструментом в исследовании объектов в наномасштабе.Конструктивно ПЭМ схож с традиционным оптическим микроскопом: вкачестве источника света выступает катод электронной пушки; конденсор иобъективпредставленымагнитнымилинзами;окулярпредставленпроекционными магнитными линзами. В качестве света, попадающего насетчаткуглаза,выступаетпучокэлектронов,проявляющийсяналюминесцирующем экране или фотопластинке.Магнитные линзы представляют собой несколько тысяч витков проволоки,через которые пропускают ток.
Ток создает магнитное поле, которое отклоняетпопадающие в него электроны.Изображение объекта в ПЭМ формируется электронами, проходящимисквозь ультратонкий слой образца толщиной не более 100 нм (при этом долярассеянных электронов мала) и взаимодействующими с образцом. Если в35световой микроскопии дифференцировка объектов достигается с помощьюкрасителей, то в электронной микроскопии в качестве красителей выступаютэлементы с тяжелым атомным весом, интенсивно рассеивающие электроны.Биологические объекты для исследования в ПЭМ обычно наносят намедные сеточки, покрытые тонкими пленками-подложками (формвар, коллодий,углерод). Но поскольку биологические объекты сами состоят легковесных атомов(H, C, N, O, P, S), то при использовании электронного микроскопа возникаетпроблема отсутствия контраста, которую решают, используя тяжелые металлыили их соли.При контрастировании объектов металлами используют так называемуюметодику оттенения металлами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
