Диссертация (1102290), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Распределение по длинам палочкообразных агрегатов σ70-субъединицы,нанесенных из растворов, содержащих (а) 2мM NaCl, (б) 20 мM NaCl, 5 мM MgSO4.Для исключения влияния примеси каких-либо полимерных образований настимуляцию агрегации были исследованы образцы раствора белка, пропущенногочерез ультрафильтры. Раствор с σ70-субъединицей дикого типа был пропущенчерез ультрафильтр YM-100, отсеивающий белки с массой, превышающей 100кДа. Таким образом, в фильтрате должны были оказаться только мономеры белка.Фильтрат был нанесен на поверхность слюды и исследован методом АСМ.
Кромебольшого числа мономеров белка, на изображениях АСМ наблюдалисьпалочкообразные агрегаты диаметром 5,4 нм (рисунок 2.8 а,b).54Рисунок 2.8. АСМ-изображения осадка σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coli на 1 и2 фильтре (a) и (c); (b) и (d) - фильтрат после 1-го и 2-го фильтра соответственно.
Как осадок нафильтре, так и фильтрат были нанесены на поверхность слюды из раствора, содержащего 20мМ NaCl и 5мМ MgSO4.Поскольку агрегаты не способны пройти через поры ультрафильтра, тоочевидно, что они образовались вновь из мономеров фильтрата. В следующемэксперименте, полученный фильтрат снова подвергся фильтрации, но уже спорогом 30 кДа.
Полученные АСМ-изображения представлены на рисунке 2.8 с и2.8 d. Оказалось, что образцы вторичного фильтрата не содержат ни фибрилл, нимономеров. Данные результаты подтвердили предположение о непосредственной55причастности σ70-субъединицы, а не других белковых примесей и частичногидролизованных фрагментов, к образованию палочкообразных агрегатов.Дляисключения“эффектаподложки”изслюдынаобразованиепалочкообразных агрегатов при нанесении раствора белка была использованаповерхность гидрофобного и электрически нейтрального (в отличие ототрицательнопиролитическогозаряженнойграфитавводе(ВОПГ).Вслюды)этомвысокоориентированногослучаетакженаблюдалисьпалочкообразные агрегаты диаметром около 5 нм и длиной 50-200 нм, ихсодержание среди всей массы адсорбированных молекул белка из раствора 20 мMNaCl, 5 мM MgSO4 составило приблизительно 5% (рисунок 2.9).Рисунок 2.9.
АСМ-изображение σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coli, нанесеннойна ВОПГ из раствора концентрацией 1,4 мкг/мл, содержащего 20 мM NaCl, 5 мM MgSO 4.Размер изображения 2,2 мкм.Согласно литературным данным, формирование амилоидных фибриллпроисходит, главным образом, вследствие частичной или полной денатурации56белков [89].
Однако в некоторых случаях это возможно в результатекратковременной флуктуации в третичной структуре без потери нативногосостояния: обнажаются некоторые скрытые в глобуле участки, что способствуетмежмолекулярному взаимодействию [90]. Lowe с соавторами в приготовленииобразцов для электронной микроскопии использовал уранила формиат [9].
Мы жепродемонстрировалиспонтаннуюсамоорганизациюσ70-субъединицывамилоидные фибриллы при мягких условиях, приближенных к физиологическим.Можно предположить, что и в нативном состоянии белок склонен к амилоиднойагрегации. Кроме этого, вероятно, фибриллобразование является конкурентнымпроцессом в попытке закристаллизовать σ70-субъединицу.2.3. Специфическое окрашивание Конго красным. ЭлектрофорезМорфология палочкообразных агрегатов σ70-субъединицы, наблюдаемаяметодом АСМ, оказалась подобна морфологии амилоидных фибрилл, описанныхв литературе (рисунок 2.10): палочкообразная форма диаметром 5,4 ± 0,2 нм.абвРисунок 2.10: (a) лизоцим [91] (б) мутант амилоидного β-пептида [92] и (в) σ70субъединица.Дляполученияболееубедительныхданныхамилоиднойприродыобразованных σ70-субъединицей агрегатов были проведены эксперименты по57специфическому окрашиванию Конго красным и нерастворимости в ДСН (данныеэксперименты проведены к.х.н.
В.Л. Друцой (НИИ ФХБ им. Белозерского МГУ) ик.х.н. О.Н. Королёвой (химический факультет МГУ))Конго красныйДля экспериментов с Конго красным помимо свежего белка, использовалсябелок, хранившийся в глицерине при - 20°С около трех месяцев. Добавлениекрасителя в раствор белка привело к сдвигу максимума адсорбции Конгокрасного. Вычитание спектра взятого отдельно красителя из суммарного спектрас белком дало разностный спектр с максимумом на длине волны 530-540 нмАдсорбцияАдсорбция(рисунок 2.11).Длина волны (нм)Длина волны (нм)Рисунок 2.11: (a) Спектры Конго красного в отсутствии (CR) или присутствии 0,7 мкМпрепарата свежевыделенной σ70-субъединицы (CR + σ70 new) или хранившейся в течение трехмесяцев (CR + σ70 aged).
Спектр 5 мМ фосфатного буфера (150 мМ NaCl, pH 7.4), был вычтен извсех измеренных спектров. (b) Разностный спектр, полученный вычитанием спектра взятогоотдельно красителя и спектра взятого отдельно белка из суммарного спектра красителя сбелком, полученного в (a).Избирательное взаимодействие данного красителя с молекулами σ70субъединицы привело к появлению красной линии (~540 нм) на оптическомспектре адсорбции Конго красного, что свидетельствует о наличии β-структур в58агрегатах σ70-субъединицы и подтверждает их амилоидную природу.Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)Олигомеры амилоидогенных белков, оказывается, достаточно стабильныдля исследования методом Laemmli [23,93,94]. На рисунке 2.12 представленыэлектрофореграммы в ПААГ σ70-субъединицы с различным временем храненияпри - 20°С в глицерине, в буфере c 10%-м додецилсульфатом натрия.
По данным2.12 (a) видно, что свежие препараты белка представлены, главным образом,одной полосой, тогда как для хранившегося белка имеются размытые полосы,причем как в разделяющем геле, так и на старте в гель.Рисунок 2.12. Электрофоретический анализ препаратов σ70-субъединицы в 10%-номденатурирующем ПААГ, содержащем 1% ДСН (а) и в 5% нативном ПААГ (б):свежевыделенный препарат (дорожка 1), а также препараты после хранения при - 20°С вглицерине в течение 3 месяцев (дорожка 2) и 10 месяцев (дорожка 3).
Электрофорез проводилив трис-глициновом буфере (pH 8.6). Дорожка M содержит белковые маркеры с идентичноймолекулярной массой (в кДа). Стрелка указывает положение мономеров белка. Агрегатывыделены вертикальной скобкой.Полосысозначениями молекулярной массы 140, 210, 280кДа,соответствующие олигомерам белка, также наблюдались для хранившихся59образцов. На электрофореграмме 2.12 (b) в отсутствие денатурирующего агентаДСН картина похожая, однако повышенное процентное содержание агрегатов свысокой молекулярной массой на входе в гель по сравнению с данными для ДСНгеля говорит о наличии аморфных агрегатов среди всей массы белковыхобразований.2.4. Влияние N-концевого домена на способность к агрегации σ70субъединицы РНК-полимеразыКак уже отмечалось, молекулярные механизмы образования амилоидныхфибрилл не вполне известны.
В структуре σ70-субъединицы изучены некоторыефункциональные домены (рисунок 2.13), ответственные за связывание с корферментом (участки 2.1-2.2), распознавание промотора (участки 2.4 и 4.2),связывание с регуляторными факторами и др. [7,8,95]. В отличие от доменов 2, 3и 4, функция N-концевого домена (участок 1.1) не полностью ясна.участкиРисунок2.13.Расположениемутаций.Линейнаядиаграммаσ70-субъединицы.Определены неконсервативные и консервативные (1,2,3,4) участки. Показана аминокислотнаяпоследовательность участка 1.1.60В работах по исследованию производных σ70-субъединицы с усеченным Nконцом говорится об ингибировании участком 1.1 процесса связывания белка сДНК [96–98]. Кроме этого, по всей вероятности, участок 1.1 являетсяпринципиально значимым в формировании холофермента [99].
Было показано,что делеционный мутант ∆1-100 с полностью отсутствующим участком 1.1 менеестабилен в комплексе с кор-ферментом, чем дикий тип белка [100]. Насегодняшний день не удалось закристаллизовать N- и C-концевые домены σ70субъединицы. Вероятно, эти частично разупорядоченные участки внутри белкапрепятствуют его полной кристаллизации и влияют на образование амилоидов[101].Для того, чтобы предложить модель агрегации амилоида σ70-субъединицыРНК-полимеразы E. coli, исследовалась роль N-концевого участка.
С этой цельюиспользовались мутантные образцы белка с делециями ∆1-73 (D1) (удалено 73аминокислотных остатка от N-конца), ∆1-100 (D2) (удалено 100 аминокислотныхостатков от N-конца) и ∆74-100 (D4) (внутри удалено 26 аминокислотныхостатков) (данные образцы получены в лаборатории В.Л.Друцы НИИ ФХБ им.А.Н.Белозерского МГУ) в сериях экспериментов in vitro. Способность мутантныхбелков к формированию амилоидоподобных структур исследовалась методомАСМ, как основным, а также ПЭМ, как дополнительным.Как описано в разделах 2.2 и 2.3, эксперименты с σ70-субъединицейпоказали спонтанную агрегацию белка в палочкообразные амилоидные фибриллыдиаметром 5,4 ± 0,2 нм и различной длиной, варьирующей от 10 до 300 нм взависимости от ионного окружения. Была поставлена задача исследоватьсамоорганизацию мутантных вариантов σ70-субъединицы и сравнить результаты сданными по дикому типу белка. Поскольку ионное окружение влияет наобразование агрегатов σ70-субъединицы, в качестве начальной концентрациисолей раствора было выбрано значение 20мM NaCl, 5мM MgSO4, при которойнаблюдалось наибольшее число агрегатов σ70-субъединицы дикого типа.Все три типа мутантной σ70-субъединицы проявили способность кобразованию палочкообразных агрегатов, как и в случае с σ70-субъединицей61дикого типа (рисунок 2.14, на вставке продемонстрированы агрегаты σ70).Диаметр фибрилл исследованных мутантных белков оказался приблизительноодинаковым (в пределах погрешности) для всех и схожим с диаметром агрегатовσ70-субъединицы дикого типа (D1: 5,2 ± 0,2 нм; D2: 5,0 ± 0,2 нм; D4: 5,3 ± 0,2 нм;дикий тип σ70-субъединицы: 5,4 ± 0.2 нм).
Однако наблюдалось различие вколичестве агрегатов. Это проиллюстрировано на АСМ-изображениях (рисунок2.14 а-с), полученных для образцов мутантных белков, приготовленных приидентичных условиях и равных начальных концентрациях.Как и в вышеописанных экспериментах, при количественной оценкесодержания палочкообразных структур в конкретном образце использовалосьсоотношение их объема к объему всех адсорбированных молекул белка(измерения проводились на основании данных АСМ).Необыкновенно высокая способность к формированию палочкообразныхструктур наблюдалась для мутанта D1: содержание агрегатов, адсорбированныхна поверхность слюды из раствора белка, содержащего 20мM NaCl, 5мM MgSO4,достигало 76%, что почти в 10 раз выше по сравнению с результатами для σ70субъединицы дикого типа (8%).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
