Диссертация (1102290), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Дляминимизации механического влияния зонда кантилевера на поверхность слюдызадавалось большое значение рабочей амплитуды (90-95% от значения амплитудыколебаний вдали образца).Сканирование σ70-субъединицы (и ее мутантов) в жидкости осуществлялосьпо следующей процедуре. Капля раствора белка концентрацией 5-80 мкг/мл исодержанием солей 20-40 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4 в объеме 10 мкл наносилась насвежесколотую и предварительно обработанную ионами Na+ и Mg2+ поверхностьслюды. Выбор концентрации электролитов был основан на данных экспериментовсмаксимальнымобразованиемфибрилл.ПолучениеАСМ-изображенийосуществлялось в полуконтактном режиме микроскопа с использованиемжидкостной ячейки.АСМ-изображения обрабатывались с помощью программного обеспеченияФемтоскан (Центр перспективных технологий, Россия).Просвечивающая электронная микроскопияПЭМ-изображения σ70-субъединицы и ее мутантов были получены в НИИФХБ им.
Белозерского МГУ совместно с к.т.н. С.С. Абрамчуком, а также в ФБУН46ГНЦ ВБ “Вектор” к.ф.-м.н. Д.В. Корнеевым.Дикий тип белка σ70-субъединицы был визуализирован на просвечивающемэлектронном микроскопе LEO 912 AB OMEGA фирмы Zeiss (Германия). Дляприготовления образца раствор белка в объеме 10 мкл наносился на медную сеткус ФВК и далее визуализировался при ускоряющем напряжении 100 кВ.В экспериментах с мутантными вариантами σ70-субъединицы cтандартнуюмедную сетку для электронной микроскопии, покрытую формваровой пленкой,стабилизированной термическим напылением углерода, лицевой сторонойпомещали на каплю (10 мкл) суспензии мутантов белка. После 1 минутыинкубации сетку удаляли с капли и высушивали фильтровальной бумагой. Затемсетку помещали лицевой стороной на каплю (10 мкл) 2%-водного растворауранилацетата, инкубировали 20 секунд, и высушивали фильтровальной бумагой.Сеткиисследовалисьприускоряющемнапряжении80кВ,используяпросвечивающий электронный микроскоп JEM 1400 фирмы Jeol (Япония).2.2.
Спонтанная агрегация σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coliТипичное АСМ-изображение σ70-субъединицы РНК-полимеразы E. coli,нанесенной на поверхность слюды из 10 мМ раствора NaCl, представлено нарисунке 2.1 (а).Призаданныхусловияхσ70-субъединицапредставляетсобойасимметричный белок с распределением высот в диапазоне 1-4 нм.
Это видно изгистограммы, представленной на рисунке 2.1 (b): уширенный пик свидетельствуетоб адсорбции различных молекул на поверхность слюды различными сайтами,приводя тем самым к разбросу значений высот на АСМ-изображениях.Согласно данным электронной микроскопии σ70-субъединица в составеРНК-полимеразы имеет асимметричную форму с аспектным соотношением,близким к 4 [86]. Однако трехмерная структура σ70-субъединицы в свободномсостоянии все еще не расшифрована, и полученные данные АСМ показывают, что47Число частицВысота частиц, нмРисунок 2.1: (a) АСМ-изображение σ70-субъединицы РНК-полимеразы (160 мкг/мл),нанесенной из раствора (10 мM NaCl) и (b) гистограмма распределения по высотам.
Размеризображения 3,15 мкм.и в свободной форме белок выглядит подобно тому, как в комплексе всегофермента.Помимомономеровσ70-субъединицытакженаблюдалисьпалочкообразные агрегаты диаметром 5,4 ± 0,2 нм и большим разбросом длины(рисунок 2.2). Они были изучены более подробно.Рисунок 2.2. АСМ-изображение палочкообразных агрегатов σ70-субъединицы РНКполимеразы E. coli.48АСМ-изображения с высоким пиксельным разрешением, полученные припониженныхзначенияхамплитудывынужденныхколебанийкантилевераотносительно его амплитуды колебаний при первичном контакте с поверхностью(то есть, соответствующих повышенной силе механического взаимодействиякантилеверасобразцом)позволилинаблюдатьспиральнуюструктурупалочкообразных агрегатов (рисунок 2.3).Рисунок 2.3.
АСМ-изображения мутанта σ70-субъединицы (см. раздел 2.4), полученныесканированием на воздухе.49На основании АСМ-данных спиральных фибрилл дикого типа белка и егомутантов был измерен шаг спирали и построена гистограмма распределенияпериодов витка спирали (рисунок 2.4).Средняя длина витка спирали, согласно гауссовой аппроксимации,составила 20 ± 5 нм.Интересно отметить, что все полученные спиральныефибриллы белка и его мутантов оказались левозакрученными, что соответствуетхиральности других описанных в литературе амилоидных фибрилл [87].Рисунок 2.4. Гистограмма распределения периода витка спиральных фибрилл σ70субъединицы и ее мутантов.Для оценки интенсивности палочкообразной агрегации и ее зависимости отразличных условий был подсчитан объем различных форм адсорбированногобелка и определена массовая доля агрегатов в предположении одинаковойплотности белка, находящегося в разных формах. Содержание палочкообразныхадсорбатов σ70-субъединицы из раствора с концентрацией NaCl < 2 мМ на50поверхности слюды оказалось в пределах 0-1% в зависимости от конкретногообразца.Такое незначительное содержание, какправило, оставляет ихнезамеченными при исследовании другими методами, тогда как АСМ позволяетувидеть белковые ассоциаты даже при чрезвычайно низкой концентрации врастворе.Существенное увеличение количества адсорбированных молекул белка (в 510 раз) наблюдалось при его нанесении на поверхность слюды из раствора 20 мМNaCl, 5 мМ MgSO4.
Для сравнения, объем адсорбатов 1 мкг раствора σ70субъединицы с содержанием 1 мМ NaCl и 20 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4 составилсоответственно 6100 и 56500 нм3 (значения стоит рассматривать как оценкусверху из-за известного эффекта уширения АСМ) на площади в 1 мкм2.Повышениеэлектролита,физическойсудяпоадсорбциивсему,белкапроисходитсвувеличениемконцентрациирезультатеэкранированияэлектростатического отталкивания мономеров отрицательно заряженной σ70субъединицы друг от друга и от поверхности слюды [4,88]. Так, для концентрациираствора электролита 20 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4 содержание палочкообразныхагрегатов возросло до 8%.В одной из работ по исследованию σ70-субъединицы методом электрофорезапредставлены следующие данные.
На электрофореграмме обнаружены полосы,соответствующие агрегатам с большой молекулярной массой. Авторами быловыдвинуто предположение о том, что хранение белка может быть фактором,ответственным за рост агрегатов [11]. Для проверки данного предположения былпроведен эксперимент с раствором белка, хранившимся 3 месяца в раствореглицерина при температуре -20°С. Раствор был нанесен на поверхность слюды сиспользованием той же процедуры, что применялась для свежего белка.
Нарисунке 2.5 представлены АСМ-изображения (a) – свежего и (b) – хранившегосяв течение 3 месяцев препарата σ70-субъединицы РНК-полимеразы, нанесенного израствора (20 мM NaCl, 5 мM MgSO4) при концентрации 160 (a) и 55 (b) мкг/мл.51Рисунок 2.5. АСМ-изображение σ70-субъединицы РНК-полимеразы, нанесенной израствора раствора (20 мM NaCl, 5 мM MgSO4) в концентрации 160 (a) и 55 (b) мкг/мл. (a) свежий препарат, (b) – препарат, хранившийся в течение 3-х месяцев в глицерине притемпературе -20°С.Нарисунке2.5(b)(хранившийсяобразец)наблюдаютсякакпалочкообразные агрегаты (приблизительно в том же количестве, что и на свежемобразце), так и другие бесформенные образования. Это позволяет сделать вывод отом, что хранение в данном случае не является фактором роста палочкообразныхструктур.С целью определения влияния ионной силы на интенсивность агрегации σ70субъединицы был исследован раствор белка при различных концентрациях солей,обычно содержащихся в клетке (NaCl, MgSO4).
σ70-субъединица являетсяотрицательно заряженной при нейтральном значении pH, так же, как и слюда вводе, и положительно заряженные ионы служат в качестве мостика между белкоми поверхностью слюды. Следовательно, увеличение концентрации электролита в52определенных пределах должно приводить к увеличению адсорбции белка. Нарисунке 2.6 представлены АСМ-изображения белка, нанесенного на слюду израствора, содержащего 2 мM NaCl (a, c) или 20 мM NaCl, 5 мM MgSO4 (b, d),концентрацией 5 мкг/мл (a, b) и 2,5 мкг/мл (c, d) соответственно.Рисунок 2.6. АСМ-изображения σ70-субъединицы РНК-полимеразы E.
coli, нанесеннойна слюду из раствора, содержащего 2 мM NaCl (a, c) или 20 мM NaCl, 5 мM MgSO 4 (b, d),концентрацией 5 мкг/мл (a, b) и 2,5 мкг/мл (c, d) соответственно. Размер изображений 2,5 мкм.Анализ большого количества АСМ-изображений (>100) подтвердил, как ипредполагалось,увеличениеагрегациипалочкообразныхструктурприувеличении концентрации NaCl и добавлении MgSO4. Кроме получения АСМизображений палочкообразных структур при различных условиях и ихкачественного анализа, полученные данные были проанализированы также и53количественно:построеныгистограммыраспределенияпалочкообразныхагрегатов по длинам.На гистограммах (рисунок 2.7) представлены распределения по длинампалочкообразныхагрегатовσ70-субъединицы,нанесенныхизрастворов,содержащих 2мM NaCl (слева), и 20 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4 (справа).
В последнемслучае можно отметить появление "хвоста" на распределении в области большихдлин. Это означает, что при увеличении концентрации Na+ и добавлении Mg2+ враствор белка на слюде появляются более длинные агрегаты, в то время кака121086420050100150200250Lengthof sigma polymers,nmнмДлина палочкообразныхагрегатов,300агрегатовЧисло палочкообразныхof sigma polymersNumberагрегатовЧисло палочкообразныхNumberof sigma polymersсредняя их длина остается прежней.б14121086420050100150200250300Длина палочкообразныхагрегатов,Lengthof sigma polymers,nmнмРисунок 2.7.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
