Диссертация (Атомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы E.coli), страница 12

Ярковыраженный эффект возрастания числа палочкообразных агрегатов для мутантаD1 показывает, что удаленный участок (1-73) может функционировать каклокальный шаперон, защищающий белок от интенсивной агрегации.Геномная ДНК клеток E. coli rpoD285 (rpoD800) содержит мутацию в генеσ70-субъединицы. В результате эти клетки не могут расти при повышеннойтемпературе в диапазоне 37-42°С из-за того, что мутантная σ70-субъединицабыстро разрушается при таких условиях [130].

Такие клетки используют для того,чтобы проверить свойства других искусственных мутантных σ70-субъединиц,которые продуцируют в этих же клетках с короткой плазмидной ДНК (плазмидувводят в клетки, где есть данный исследуемый мутантный ген): если приповышенной температуре клетки с плазмидой выживают, значит искусственнаяσ70-субъединица фактически заменяет обычную природную σ70-субъединицу,способную обеспечить рост при 37-42°С (и исследуемая мутация не влияет наосновную функцию). В таком случае говорят, что искусственная σ70-субъединицакомплементирует термочувствительный штамм клеток, а если клетки приповышенной температуре по-прежнему не выживают, значит, исследуемыймутант нарушил функцию σ70-субъединицы.В одной из работ Dombrоski исследовал делеционные мутантные σ70субъединицы, лишенные 50 либо 72 аминокислотных остатка от N-концевойчасти белка, путем их экспрессии в температурочувствительном штамме [96].Оказалось,чтомутантсделецией1-50аминокислототN-конца некомплементирует температурочувствительный штамм (клетки с этим мутантом нерастут при температуре в диапазоне 37-43°С).

Значит, исследованный мутантоказался в чем-то дефектен, и не выполняет функцию σ70-субъединицы. В этомконтексте можно интерпретировать высокую склонность к формированию89амилоидных фибрилл мутантом D1 и в наших экспериментах: укороченная σ70субъединица просто агрегирует.Предлагаемая модель представлена на рисунке 4.1. Амилоидогенный белокпредставлен в виде “кофейной чашки”, в котором “ручка” и “чаша”соответствуют частично разупорядоченному участку и структурированнойглобуле, соответственно. Первый этап сборки – образование димера (чтосогласуется с моделированием). Следующий шаг агрегации включает добавлениечастично (или полностью разупорядоченных) мономеров. Модель не исключаетприсоединение более сложных блоков (как, например, стабильных димеров) впроцессе полимеризации.

Вследствие гибкости разупорядоченных “ручек” ивращению “чаш” растущий полимер (“белковый конкатамер”) проявляетчервеобразную морфологию (рисунок4.1, A). Однако при достиженииопределенной длины (специфической для каждого отдельного белка), олигомерзамыкается в псевдоцикл (рисунок 4.1, B). Такое замыкание можно рассматриватькак “ядро” для запуска роста амилоидных фибрилл по спиральному типу.

Если жедлина олигомера превысит некоторый критический размер, то в таком случаеагрегация пойдет по пути образования червеобразных “бусин на нити”.Предложенная модель может объяснить различные наблюдаемые приисследованиифибриллявления.Вчастности,различиевморфологиичервеобразных и фибриллярных агрегатов одного и того же белка можнообъяснить вариациями в раскрытии “самокомплементарных участков” взависимости от окружающих условий. Более того, модель допускает разветвлениеолигомеров с образованием вторичных сайтов нуклеации, а также формированиезакрытых колец. Значительная вариация диаметра “бусин” внутри одного образцачервеобразной структуры σ70–субъединицы означает наличие сайтов ветвления(см. рисунок 3.3). В то же время, АСМ-сканирование белка показало идентичнуювысоту и спиральную структуру палочкообразных агрегатов c размером витка ~20 нм.90линейныеразветвленныечервеобразные полимерымономерамилоидРисунок 4.1.

Модель “кофейных чашек” амилоидной агрегации белков.Вероятно, спираль имеет поворотную симметрию третьего порядка. Витокпредставляет собой треугольник с бусинами в вершинах, что согласуется спростой геометрической моделью: гипотетическая высота H трех плотноупакованных, расположенных в вершинах равностороннего треугольника “бусин”(которые мы считаем димерами σ70-субъединицы) диаметром d будет равна: =(1 + √3/2). Учитывая измеренное значение высоты бусины методом АСМ вжидкости - 4,2 ± 0,6 нм, H ≈ 7,8 ± 1,1 нм. Это значение неплохо согласуется сизмеренным АСМ в жидкости диаметром палочкообразных агрегатов 6,2 ± 0,6 нм(занижение можно объяснить эффектом влияния зонда на образец).

Кроме этого,оценка числа мономеров белка на один виток по АСМ-данным также согласуетсяс предложенной моделью:считая форму палочкообразных агрегатов σ7091субъединицы приближенно цилиндрической, а плотность приближенно равнойплотности воды (1000 г/м3), получим, что, с учетом молекулярной массы белка 70кДа, на один виток спирали приходится ~ 5,2 мономера. Полученное значениеблизко к вытекаемому из модели «кофейных чашек» шести мономеров,приходящихся на один виток спирали.

Небольшое несоответствие может бытьсвязано с неточностями в форме и плотности белковых агрегатов.Поворотная симметрия третьего порядка ранее была предложена дляобъяснения структуры фибрилл амилоидного β-пептида (рисунок 4.2) и амилина[131–135]. В такой модели амилоидные структуры образованы стопкойтреугольников, перпендикулярных оси фибриллы, тогда как в случае σ70субъединицымодельпредставляетсобойспиральнуюповоротнуюпсевдосимметрию третьего порядка.

Модели амилоидной агрегации с различнымитипами спиральной поворотной симметрии описаны в работах [136,137].BCРисунок 4.2. (A) ПЭМ-изображения фибрилл амилоидного β-пептида (1-40) снегативным контрастированием демонстрируют периодическую скрученную морфологию сочевидной модуляцией ширины. (B) Схематическое объяснение наблюдаемой на изображенияхПЭМмодуляциишириныфибриллсприблизительнотреугольнымсечением.(С)Схематическое представление фибрилл с поворотной симметрией третьего порядка [131].92Заключение и выводыИсследования белковых фибрилл, образующихся в результате сборкибелков или пептидов в длинные, нерастворимые, высокоупорядоченныеструктуры, является одной из наиболее динамично развивающихся научныхобластей.

Движущая сила их образования, молекулярные механизмы, структураамилоидных фибрилл, способы предотвращения роста амилоидных фибрилл ифункциональная значимость появления в клетке, а также многие другиепроблемы, связанные с амилоидными фибриллами, – вопросы, которые являютсяпредметом исследования многих лабораторий мира.В данной работе впервые продемонстрировано, что σ70-субъединица РНКполимеразы E.

coli способна к спонтанному образованию амилоидоподобныхагрегатов in vitro. Для исследования агрегации белка применялся метод атомносиловой микроскопии как основной. При изучении палочкообразных агрегатовдикого типа белка было продемонстрировано, что агрегаты σ70-субъединицыимеют определенную фибриллярную форму диаметром ~ 5,4 нм (по даннымАСМ) и длину до 300 нм.Небольшое содержание фибрилл белка, обнаруженное с помощью АСМ,может быть принципиальным препятствием для их обнаружения традиционнымимолекулярно-биологическимиметодамиисследования(гель-электрофорез,хроматография и др.).

Использование АСМ показало эффективность изучениябелковых агрегатов, так, метод позволил увидеть морфологию отдельныхнаночастиц с высоким разрешением и провести количественный анализ.На основании известных данных о структуре σ70-субъединицы былоисследовано влияние N-концевого участка на агрегацию белка. Три типамутантной σ70-субъединицы (лишённые полностью или частично N-концевогодомена) показали способность к образованию агрегатов, подобных агрегатам σ70субъединицыдикоготипа.Количественныеоценкиагрегациимутантовпозволили сделать вывод о том, что разупорядоченные участки N-концевогодомена препятствуют интенсивной агрегации белка.93Было исследовано влияние солевого окружения на способность к агрегацииσ70-субъединицы и ее мутантов.

При критически низком содержании электролитаспособность к агрегации σ70 субъединицы оказалась практически нулевой, чтоможно объяснить электростатическим отталкиванием мономеров белка (суммарноимеющегоотрицательныйзаряд).Приумеренномсодержаниисоли(концентрация NaCl 20-40 мM) электростатическое отталкивание уменьшаетсявследствие Дебаевской экранировки, и становится возможным близкий контактмономеров белка, что приводит к увеличению вероятности агрегации.

Придальнейшем увеличении ионной силы становится более вероятным компактноесостояние σ70-субъединицы, поэтому наблюдалось понижение способности белкак агрегации при 100-200 мM NaCl. Роль MgSО4 может заключаться вдополнительной стабилизации уже образованных агрегатов σ70-субъединицы.Исследование тонкой структуры фибрилл σ70-субъединицы выявилолевозакрученную спиральность с шагом витка ~ 20 нм.Кроме палочкообразных фибрилл были обнаружены также червеобразные“бусины на нити”. Исследование их модуля Юнга (который составил 7,8 – 12,3МПа в зависимости от ионной силы раствора) и его сравнение со значениями излитературных данных по амилоидным фибриллам (порядка гигапаскалей),позволило сделать вывод об альтернативном неамилоидном пути агрегации σ70субъединицы.