Диссертация (Атомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы E.coli), страница 10

(a) Функции автокорреляции интенсивности ДДРС и (b) спектрырелаксации при угле рассеяния 40 °.73Полученные функции автокорреляции демонстрируют более быстрый спаддля случая деполяризованного света, что согласуется с уравнениями для ГVV иГVH. Распределение релаксаций было получено деконволюцией функцийкорреляций: видно наличие двух мод для распределения VH и трех – для VV.

Втерминах гидродинамического радиуса, более быстрые моды соответствовали ~25–35 нм, а более медленные - 530–550 нм и выше.Оценка позволяет предположить, что медленные моды соответствуютбесформенным агрегатам σ70-субъединицы, описанным в 2.2. В то же время,наличие быстрых мод, по-видимому, связано с наличием палочкообразныхагрегатов. Эти моды не монодисперсны, что означает наличие частиц разныхразмеров и согласуется с разными длинами фибрилл белка. Полученныераспределенияпозволяютприблизительнооценитьдлинуиширинупалочкообразных агрегатов в растворе.

Подставлением оценки Dt и Dr быстроймоды в уравнения для расчета длины и диаметра, были получены значения ~ 770нм и ~ 0,9 нм соответственно, что подтверждает наличие палочкообразныхструктур.АСМДДРСДлина, нмДиаметр, нмДлина, нмДиаметр, нм140 ± 105,4 ± 0,2770 ± 900,9 ± 0,5Таблица2.1.Сравнениеморфологическихпараметров(длиныидиаметра)палочкообразных агрегатов D4 мутанта σ70-субъединицы, полученных двумя методами: АСМ иДРС (в растворе 40 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4).При сравнении данных АСМ и ДДРС в таблице 1 можно наблюдатьзначительную разницу в измеренных величинах. О превышении количественных74данных АСМ в 10 раз по сравнению с ДДРС также сообщалось при исследованииуглеродных нанотрубок [104]. Главной причиной такого различия может служитьсвязанноесширокимраспределениемдлинпалочкообразныхагрегатовнесоответствие реального раствора агрегатов идеальному, к которому применимыуравнения (2.3) и (2.4).

Кроме этого, расхождения могут объясняться наличиемдругих форм агрегатов σ70-субъединицы (червеобразных, аморфных). Они могутвносить значительный вклад в быструю моду релаксации и сдвигать положениемаксимумов, которые используются для расчета морфологических параметров.Вместе с тем, сам факт наличия неизотропных агрегатов палочкообразнойформы в растворе белка σ70-субъединицы является важным аргументом,свидетельствующим о формировании этих агрегатов в объёме раствора.75Глава 3.

Исследование червеобразной агрегации σ70-субъединицыРНК-полимеразы E. coliКак упоминалось ранее в литературном обзоре, многие (а возможно и все)белки при определенных условиях образуют амилоидные фибриллы. Этотпроцесс проходит в несколько этапов. Согласно одной из современныхконцепций, несколько мономеров белка сначала самоорганизуются в глобулярныеагрегаты (олигомеры), затем в промежуточные интермедиаты (называемыепротофибриллами), которые впоследствии переплетаются в зрелые фибриллы(рисунок 3.1).Рисунок 3.1.

АСМ-изображения стадий амилоидной агрегации: (A) олигомеры; (B)протофибриллы и (C) зрелые фибриллы [108].3.1. Атомно-силовая микроскопия и механические свойстваинтремедиатов. Персистентная длина. Модуль ЮнгаПри исследовании образцов σ70-субъединицы на АСМ-изображениях помимопалочкообразных агрегатов наблюдались червеобразные агрегаты, имеющиеструктуру “бусин на нити” (рисунок 3.2).

Похожие агрегаты белка былиупомянуты в работе Lowe с соавторами [9], однако, без описания морфологии ивозможной роли в контексте амилоидной агрегации. Для более глубокого анализамеханизма (в частности, исследования ранних этапов) агрегации σ70- субъединицы76были привлечены разные методики.Рисунок 3.2.

АСМ-изображения червеобразных агрегатов σ70-субъединицы, имеющихструктуру “бусин на нити” (a) в жидкости, (b) на воздухе, (с) одновременное наблюдение разныхструктур на воздухе.77Червеобразные агрегаты наблюдались в широком диапазоне концентрацийсолей: от 0 до 200 мМ NaCl, 50 мМ MgSO4. По форме такие агрегаты напоминают“бусины на нити” (рисунок 3.3) с высотой бусин hb 2,9 ± 0,5 нм и 4,2 ± 0,6 нм,полученных при АСМ-сканировании на воздухе и в жидкости, соответственно, атакже расстоянием между ними lb 15-20 нм.Полученное из АСМ-данных значение высоты “бусины” превышает размерσ70-субъединицы (1,8 ± 0,3 нм). Поэтому, вероятнее всего, бусины образованыболее чем одной молекулой белка.Длявыявленияформированиизрелыхролиобнаруженныхамилоидныхчервеобразныхфибриллбыластруктурпроведенавоценкамеханических свойств и сравнительный анализ с литературными даннымипротофибрилл других белков.

Наиболее подходящей величиной для оценкижесткости или упругости амилоидных агрегатов является персистентная длина P,на которой полимер начинает изгибаться в разных направлениях вследствиетепловых флуктуаций. Обычно анализ жесткости или упругости молекулпроводят сравнением персистентной (P) и контурной (l) длин. Для расчетаперсистентной длины использовалась модель червеобразной цепи, требующаягауссова распределения угла θ между касательными к контуру молекулы,проведёнными в точках, разделённых расстоянием l вдоль этого контура:(())2 = ( 0,5 (−2 ⁄2)) 2〈 2 ()〉 = ⁄(3.1)(3.2)Последняя формула позволяет рассчитать персистентную длину излинейной регрессии зависимости 〈 2 ()〉 = () .78b(I)c(I)b(II)c(II)Рисунок 3.3.

(a) АСМ-изображения и (b) увеличенные области (I –с мономерами и II – счервеобразными структурами) σ70-субъединицы, нанесенной из раствора 20 мМ NaCl, 30 мМMgSO4. (с) Поперечный профиль выделенных кривых.79Модуль Юнга Y связан с персистентной длиной P соотношением: = ⁄,(3.3)где kB – константа Больцмана, T – абсолютная температура, а I – момент инерцииплощади сечения фибриллы [109].На рисунке 3.4 (a) представлены зависимости 〈 2 ()〉 = () длячервеобразных агрегатов, нанесённых на подложку из различных раствороввместе с их линейной аппроксимацией.

Персистентная длина варьирует вдиапазоне 15-25 нм (таблица 1), демонстрируя предельный режим при высокойионной силе и конечное значение при отсутствии солей (рисунок 3.4, b).Подобная зависимость персистентной длины от ионной силы Is типична длязаряженных полимеров в солевом растворе, для которых электростатическийвклад в персистентную длину связан с Дебаевской экранировкой и зависит от−/2ионной силы следующим образом: ~ [110].

Таким образом, наблюдаемаязависимость является аргументом в пользу отрицательного заряда червеобразныхструктур σ70-субъединицы (что согласуется с отрицательным зарядом самогобелка). Схожее поведение персистентной длины было продемонстрировано дляодноцепочечной ДНК методом флуоресцентного резонансного переноса энергиии малоугловым рентгеновским рассеянием [110].Для расчета модуля Юнга червеобразных структур из уравнения (3.3)необходимо оценить момент инерции площади сечения I. В первом приближениидля цилиндра, считая поперечное сечение круглым с радиусом r, можно провестирасчет по формуле = 2 ⁄4 [111], а радиус взять как половину высоты“бусины” (hb/2). Однако использование приближения цилиндра завышает моментинерции площади сечения и, тем самым, занижает значение модуля Юнга (Ycyl).Для уточнения момента инерции площади сечения червеобразных структур“бусины ” были рассмотрены в виде эллипсоидов вращения с полуосями ha/2, hb/2и lb/2, что внесло поправку в виде коэффициента 15/8:80ℎ 44 15=== 1 ℎ 4 8 ()∫−ℎ4 2ℎгде () =ℎℎ(3.4)√ ℎ 2 − 2 .5 мМ MgSO4,20 мМ NaCl, навоздухе20 мМ MgSO4,20 мМ NaCl, навоздухе30 мМ MgSO4,20 мМ NaCl, навоздухе50 мМ MgSO4,20 мМ NaCl, навоздухе5 мМ MgSO4,20 мМ NaCl, врастворев отсутствиесолей, на воздухеПерсистентная длина, нмнмИонная сила, мМРисунок 3.4.

(a) 〈 2 ()〉 как функция контурной длины l для червеобразных структурσ70-субъединицы из раствора с различными концентрациями солей. (b) Расчетные значенияперсистентной длины червеобразных структур как функция ионной силы раствора.81Сравнительные данные значений модуля Юнга Ycyl и Yell представлены втаблице 1. В расчетах высоты бусин использовались данные АСМ.УсловияP, нмYcyl, МПаYell, МПаВ отсутствие солей, на воздухе24,5 ± 1,86,5 ± 0,812,3 ± 1,620 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4, на воздухе22,6 ± 1,16,0 ± 0,711,3 ± 1,320 мМ NaCl, 20 мМ MgSO4, на воздухе19,1 ± 0,45,1 ± 0,69,6 ± 1,020 мМ NaCl, 30 мМ MgSO4, на воздухе16,7 ± 0,44,5 ± 0,58,4 ± 0,920 мМ NaCl, 50 мМ MgSO4, на воздухе15,5 ± 0,44,1 ± 0,57,8 ± 0,820 мМ NaCl, 5 мМ MgSO4, в жидкости16,9 ± 0,54,5 ± 0,58,5 ± 0,9Таблица 3.1.

Персистентная длина P и модуль Юнга (Ycyl и Yell) червеобразных структурσ70-субъединицы в различных растворах солей.Рассчитанный модуль Юнга червеобразных структур σ70-субъединицыоказался в пределах 7,8 – 12,3 МПа, что говорит о высокой гибкости этихагрегатов, в противоположность зрелым амилоидным фибриллам, для которых этавеличина лежит в диапазоне 2-14 ГПа [112]. Более того, рассчитанная величинаоказаласьсущественноменьшемодуляЮнгаподобныхчервеобразныхпротофибрилл, образуемых другими белками, например, овальбумином (1,1 ГПа,[32]), α-лактоглобулином (140 МПа, [112]), или N-терминальным доменомфактора созревания гидрогеназы E.