Диссертация (Атомно-силовая микроскопия сигма(70)-субъединицы РНК-полимеразы E.coli), страница 11

coli HypF-N (60 МПа, [84]).Такие низкие значения модуля Юнга протофибрилл σ70-субъединицыговорят о наличии более слабых межмолекулярных взаимодействий, чем у зрелыхамилоидных фибрилл, и отсутствии типичной для амилоидов высокой βструктурной организации [113].823.2. Моделирование σ70-субъединицы методом молекулярной динамикиС целью получения дополнительной информации о ранних стадияхагрегации было проведено полноатомное молекулярное моделирование σ70субъединицы (основные результаты получены А.П.Толстовой и подробноописанывИсходя[114]).изрентгеноструктурнойбазыданныхзакристаллизованных белков (и их частей) PDB, в которой σ70-субъединицапредставлена 23 вариантами, была выбрана структура 4IGC с отсутствующимиучастками 1-6, 65-94, 154-212.

Модельное достраивание полной структуры былопроведено программным пакетом Gromacs и детально описано в [114]. В качествесиловогополябыловыбраноAmber99sb-ildn,асамомоделированиеосуществлено на суперкомпьютере “Ломоносов” (МГУ имени М.В.Ломоносова).Полученная полная структура σ70-субъединицы без пропусков былапромоделирована в растворах солей с концентрацией 20 мМ NaCl и 5 мМ MgCl 2.Все белки на начальный момент находились не ближе 1,5 нм для моделированиядимеризации, и не ближе 3 нм для моделирования последующей полимеризации.Каждая модель подвергалась тысячекратной минимизации, в течение 100 пс дляуравновешивания NVT и 100 пс NRT при температуре 300 К. Для моделированияводы использовалась модель TIP3P [115], для ограничения длины связей алгоритм LINCS [116].

Уравновешенная кристаллическая структураσ70-субъединицы показала наибольшую подвижность N- и C- концов, формирующих“клешни” (участки ~ 1-65 и 504-609), центральная же часть (участок ~ 130-360)оказалась высокоструктурированным доменом молекулы (NCR, рисунок 3.5 а).Для исследования димеризации σ70-субъединицы были рассмотрены 6 вариантовначальных позиций мономеров, построенных программным обеспечением VMD(каждый вариант из трех мономеров белка). Время моделирования составляло 40нс для каждого варианта.Из шести различных способов взаиморасположения мономеров, в двухслучаяхмономерыразошлисьдруготдруга;водномслучаепровзаимодействовали “самокомплементарные” участки NCR двух мономеров; а83в остальных трех случаях наблюдалась одиночная связь C-C- доменов двухмономеров (2 раза) и N-и C- доменов двух мономеров (1 раз). Однако, длямоделированиядальнейшихвзаимодействийдимеровсмономеромσ70-субъединицы, был выбран димер с наиболее прочным контактом мономеров (сучастием двух NCR-участков), его можно наблюдать на рисунке 3.5 (б).абсРисунок 3.5.

Молекулярная структура σ70-субъединицы: (а) мономера, (б) двавзаимодействующих мономера (димер) и (с) два взаимодействующих димера. NCR-участокобозначен красным, а “клешни" зеленым [114].Дальнейшее моделирование показало взаимодействие “клешней” димеров имономера. Важно отметить, что для двух различных конфигураций, несмотря на84изначально более близкое расположение к центру димера, мономер переместилсяк концу димера и “повернул клешни” таким образом, чтобы создать контакт сдимером.Подобный эффект наблюдался и для моделирования взаимодействия димердимер. Финальная конфигурация представлена на рисунке 3.5 (c), а схемавзаимодействия на рисунке 3.6.Рисунок 3.6.

Предполагаемая схема червеобразной агрегации [114].Расположение взаимодействующих димеров в одной плоскости позволилооценить персистентную длину из соотношения: 〈 2 ()〉 = ⁄. Приблизительныйподсчет среднего квадрата угла между касательными к контуру участкамолекулы, построенными на его краях (~81° или ~ 1,4 рад.), и самой контурнойдлины (~ 40 нм) на модельной структуре дал значение персистентной длины 20нм, что неплохо согласуется с экспериментальными данными АСМ (22,6 ± 1,1 нмпри условии сканирования образцов, нанесенных из раствора 20 мМ NaCl 5 мМMgSO4).

Результаты приведены в таблице 3.2. Более того, оценочная длинасмоделированного димера σ70-субъединицы составила 20 нм, что соответствуетнаблюдаемым на АСМ-изображениях расстояниям между бусинами, потомувероятно, димер и является “бусиной” на изображениях АСМ.85Высота “бусин нанити”, нмРасстояние междубусинами, нмПерсистентнаядлина, нмЧервеобразныеструктуры, АСМ4,2 ± 0,615-2022,6 ± 1,1МД6,8-3,9~2120Таблица 3.2. Сравнительные морфологические и механические характеристикичервеобразных структур, полученных на основе данных двух методов – АСМ и МД.86Глава 4. Иерархическая модель агрегации амилоидных белков4.1. Модель “кофейных чашек”Поведение дикого типа белка и его мутантных вариантов, наблюдаемое вэкспериментах, можно объяснить исходя из данных о структуре σ70-субъединицыи современных представлениях о процессе фибриллобразования.

На данныймомент трехмерная структура известна лишь для неполной σ70-субъединицы.Подвижность N- и C-концевых доменов 1.1 и 4 не позволяет получить полнуютрехмерную структуру при помощи рентгена. Тем не менее, имеются данныеблизкого расположения этих доменов друг относительно друга [96,117]. Болеетого, в экспериментах по исследованию σA Thermatoga maritima (гомолог σ70)было напрямую продемонстрировано, что домен 1.1 (σ1.1) находится в плотномрасположении к доменам 2 (σ2) и 4 (σ4) [42]. Электростатика играет важную рольв стабилизации данной упаковки, поскольку участок σ1.1 богат кислотнымифункциональными группами, в то время как участки σ2 и σ4 богаты основными.Подобнаяупаковкарассматриваетсякакпричинанаблюдаемогоаутоингибирования процесса связывания промотора ДНК со свободным сигмафактором [117–119].

В то же время, гибкость N- и C- концевых доменовобеспечивает возможность флуктуаций, из-за которых локально разрушаютсямеждоменные контакты.Согласно современной концепции, предпосылками к формированию зрелыхфибриллрассматриваютчастичноденатурированныебелки[65,118,119].Последующие стадии этого процесса могут происходить по разным механизмам[120–122]. Хорошо известно, что атрибутом амилоидных структур являетсяналичие β-складок, расположенных перпендикулярно оси фибриллы [123,124].Эти структуры имеют так называемые амилоидогенные участки, богатыегидрофобными аминокислотами [125,126].

Несмотря на небольшую длинупоследовательности таких участков, они способны превращать полностьюглобулярный белок в амилоидные фибриллы [126,127]. Анализ аминокислотнойпоследовательности σ70-субъединицы при помощи специального программного87обеспечения NETCSSP [128] показал возможные амилоидогенные участки, в томчисле расположенные в N- и C-концевых доменах. Эти участки могутспособствовать взаимодействию доменов как в мономерах, так и в агрегатах.Более того, взаимодействие между доменами может быть стабилизированоэлектростатически:ранеебылоупомянуто,чтоN-концевойдоменσ70-субъединицы отрицательно заряжен [4], в то время как С-концевой домен имеетположительный заряд.

Кроме того, частичная денатурация молекулы может статьрезультатом раскрытия других амилоидогенных участков, обычно спрятанныхглубоко внутри глобулы молекулы. В то же время, не стоит исключатьвозможности нахождения ядра фибриллообразования внутри неконсервативногоучастка NCR (nonconservative region) в виде двух антипараллельных β-складок.Как уже отмечалось ранее, процесс созревания зрелых амилоидныхфибрилл включает разные стадии, при этом в различных исследованияхчервеобразные структуры предполагаются как промежуточным звеном процесса,так и альтернативным исходом нарушения фолдинга белков.Основываясь на полученных данных, мы предложили модель (модель“кофейных чашек”), способную объяснить полученные результаты. Даннаямодель подразумевает наличие внутри белка двух “самокомплементарных”участков,обеспечивающихсамосборкубелка.Вслучаебелковкомплементарность может быть представлена специфическим пространственнымрасположениемреализованааминокислотныхостатков(амилоидогенныхучастков)ипосредством электростатики, водородных связей и гидрофобныхвзаимодействий.

В отличие от линейных фрагментов ДНК, белки, как правило,сложно пространственно структурированы, и для их взаимодействия требуетсячастичная денатурация и раскрытие амилоидогенных участков. Хорошо известно,что большинство амилоидогенных белков не структурированы, или содержатнеструктурированные участки [129].Данная модель позволяет понять поведение мутантных белков σ70 вразличных экспериментах. Частичная делеция участка 1.1 (мутанты D1 и D4)может привести к дополнительному разворачиванию мономера белка и88обеспечить более выгодные стерические условия для агрегации. Повышениеспособности к образованию фибрилл в случае мутантов D1 и D4 также можетбыть объяснено экспонированием некоторых амилоидогенных участков, которыеобычно спрятаны и экранированы в σ70-субъединице дикого типа.