Отзыв официального оппонента 1 (Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов)

Отзыв официального оппонента на диссертационную работу Макарова Дмитрия Александровича «Разработка технологий получения рекомбннантного тимозина бета-4 человека и его аналогов», представленную на соискание ученой степени кандидата химических наук по специальности ОЗ.О1.06 "Бцотехнология ~в т.ч. бионанотехнологня)" Тимозины, небольшие белки, проявляющие различные биологически важные свойства. находят применение и имектг большие перспективы использования в различных областях медицины. В частности.

тимозин Тр4, разработке эффективной биотехнологии производства которого посвящена работа Д.Л, Макарова. является важным аьтгинсвязывающим пептидом, регулирующим полимеризацию актина, обладающим выраженными кардиопротекторными и ~~ой~твами, Важн~м предс~авл~е~с~ регенерационнь|й потенциал молекулы Т~34, что может бьггь использовано в лечении трофических язв. ран ожогов, в том числе глаза человека, Следует также отметить, что принципиально важно для использования в медицине разработать и новые лекарственные формы тимознна Т~4, т.к. данная молекула весьма быстро выводится из организма.

Полому диссертационная работа Д.Л. Макарова, посвященная разработке новой эффективной биотехнологии производства рекомбинантного тимозина Тр4 и его аналогов для улучшения фармакологических характеристик, является весьма актуальной. Для достижения основной цели исследования автором поставлены такие задачи. как разработка эффективной биотехнологии пилотного производства пептида, изучение биологической активности рекомбинантного тимозина Тр4, синтез аналогов пептида с улучшенными фармакологи ескими характеристиками, разработка методов очистки аналогов, разработка подходов к проведению ферментативного ацетилирования пептида. Цель и задачи работы сформулированы четко и в полном соответствии с результатами хорошо проведенного автором анализа литературы, относящейся к теме исследования: структура и свойства тимозинов, способы получения тимозина Т~4, ацилироваиие белков ш око, биологическая активность Тр4, возможности использования пеп гида в медицине.

Научная новизна работы явно видна. В работе впервые разработана ~ффективная и легко масштабируемая, что весьма важно, технология получения рекомбииантного ТВ4 человека с использованием интеин-опосредованной экспрессионной системы. обеспечивающая селективное и высокоэффективное ацетилирование пептида ш чгео. В работе проведено исследование биологической активности Тр4 на спонтанной мышиной модели хронического лерматита и продемонстрирована эффективность пептнда в лечении хронических заболеваний кожи. Автором синтезированы 3 аналога рекомбинантного Тр4 человека, проявивших 1ювышенную стабильность в модельной системе (среде сыворотки крови кролика). Практическая значимость работы не вызывает сомнений„так как разработанная эффективная биотехнология пилотного производства позволила наработать опытную партию в 2.5 г Т1)4, пошедших на медико-биологические испытания, Кроме того.

п)зоведенне ацили1х?Вания 1п 71чо позволяет ПОВысить эффективность и экономичность получения пептида. Диссертационная работа Д.А. Макарова построена традиционно, она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения. выводов н списка литературьь В работе использованы разнообразные методы. Необходимые для оптимизации и масштабирования получения тимозина Т~)4, в частности, проведение культивирования штаммов-продуцентов в промышленном ферментере вместо качалочных колб. Следует отметить.

что найдено интересное решение удаления бачластных белков методом термической денатурации, Проведенное автором исследование зависимости количества агрегированых белков от температуры показало, что в диагизоне температур от 45 до 50'С можно осадить 2 3 всех балластных белков с очень небольшой потерей гибридного белка ~до 10'.4). Для оптимизации стадии протеолитического расщепления гибридного белка с помощью ТЕЧ-протеазы автором изучена зависимость степени расщепления белка от соотношения фермент-субстрат и найдено оптимальное соотношение 1'100 1ТЕУ'-протеаза ~' гибридный белок), при котором степень расщепления достигала 90'?'о от исходного.

Этапы наработки и очистки препарата хорошо продуманы с точки зрения легкости масштабирования процесса. Так, автором предложено решение в оптимизации и масшгабированиии стадии хроматографичсской очистки препарата дезацетилтимозина ~4, а именно замена ультрафильтрацнн на ионообменную хроматографию, что позволило не только сократить время очистки, но и повысить выход целевого пептида с 25 до 95'Ъ. Интересное решение проблемы низкого выхода целевого продукта и высокой концентрации побочных продуктов на стадии химического ацетилирования лезацетилтимозипа 114 предложено автором — термннация процесса с помощью кислот 1лимонной и малоновой). Обнаружено, что в присутствии 10мМ лимонной кислоты реакция ацетилирования практически полностью останавливалась, - это позволило в технологическом процессе многократно использовать непрореагнровавший лезацетилтимозин 134.

Важной и актуальной с точки зрения использования пептнла в медицине является часть работ.ы. посвященная получению аналогов пептила. Автором были получены гексаноилтимозин р4. а также конъюгаты с полисиаловой кислотой и ПЭГ. В каждом случае автором были разработаны пути оптимизации методов получения и очистки препаратов-аналогов Т134. Автором были использованы адекватные методы: хроматография, электрофорез, хромато-масс-спектрометрия для подтверждения состава полученного аналога пептила.

Использ)я молельную систему, сыворотку крови кролика, автор получил изменение стабильности препаратов. Так время полужизни пептида изменилось с 2 до 8, 6 и 1О ч, соответственно, для моногегсаноильного, моносиалироваиного и моноПЭГелированного аналогов Т1)4, Принципиально важной является часть работы„посвященная разработке интсннопосрелованного метода для производства рекомбинантного Тр4 нз ацетилированного 1п в)во пептнда. Здесь автором были созданы генно-инженерные конструкции, проведена экспрессия генов штаммов-продуцентов, произведен гибридный белок. Автором проведена оптимизация условий по времени инкубирования после индукции, по использованию разных питательных сред, по температуре инкуоирования. Были опробованы 2 1цтаммапродуцента и две ацетилтрансферазы.

В результате проведенного исследования автору ульоюсь добиться высокого выхода 17400) целевого пептида Т~4, который удалось повысить еще больше гдо 93,"0), оптимизируя время после индукции 120ч), На последнем этапе работы была изучена эффективность рекомбинантного Т1)4 на животной модели аз м)чо. Были использованы мыши двух возрастных групп с хроническим дерматитом. Следует отметитгь что обработка поверхности мышей с признаками дерматита рекомбинантным Тр4 приводила к достоверному ослаблению проявлений хронического лерматита, хотя и в разных пропорциях для разных возрастных групп.

В целом результагы представлены ~опытно, довольно подробно изложены и логично направлены на достижение поставленной цели. Выводы работы полностью соответствуюг данным экспериментов и логично слелчот из графиков, диаграмм, таблиц. что делает восприятие обсуждения результатов простым и удобным. Полу генные результаты являются достоверными, Обсуждение приведено одновременно с описанием результатов и вглглядит ЛОГИЧНО. Выводы вытекают из полученных результатов и являются обоснованными. Все результаты работы опубликованы и представлены на ряде конференций.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе четыре статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК 1одна из статей в международном журнале), 3 тезиса докладов в сборниках научных конференций, получено 4 патента. Диссертация написана логично, хорошим языком, изложена на 100 страницах и состоит из Введения, Обзора лнтературы, Описания методов исслелования, четырех глав Результатов и их Обсуждения, Выводов и списка цитируемой литературы, насчитывающего 185 ссылок. Диссертация хорошо илл|острнрована, в ней содержится 46 рисунков и 9 таблиц.

Следует отметить, что, несмотря на высокое качество работы и хорошее впечатление от ее прочтения, в работе присутствует целый ряд опечаток: фосфотаза, пердшественников. препартов, сольюбнлизировали и др, В некоторых местах список литературы начинается с фамилии первого автора, в некоторых — с названия. Кроме того, есть некоторые замечания и ВОПРОСЫ: 1, Несколько необычно выглядит раздел методы, где для каждого из больших пунктов разработки вставлен собственный пункт материалы. Такое разбиение, в общем, оправдано„т.к. в работе разбираются принципиально разные подходы.