Диссертация (Прогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля), страница 12

Для получения воспроизводимыхвремен удерживания колонку с предколонкой термостатировали при 25°С. Вкачестве подвижных фаз использовали 0.1% растворы муравьиной кислоты в воде(А) и ацетонитриле (В). Разделение компонентов проводили программируемымградиентным элюированием: 0 мин – 5% (В); 7 мин – 95% (В); 9 мин – 95% (В);9.5 мин – 5% (В); 12 мин – 5% (В), при скорости потока элюента 150 мкл/мин,объем пробы – 3 мкл, общее время анализа – 12 мин.Детектирование исходных пептидов и их метаболитов проводили в режимерегистрации положительных ионов. Параметры масс-спектрометра TSQ Quantivaследующие: температура нагреваемого электроспрея – 325C; напряжение нараспылителе–3.5 кВ;температуравнутреннегокапилляра–275°С.Детектирование исходных соединений и их метаболитов осуществляли в режимеSRM при следующих условиях: время полного цикла сканирования – 1 с;давление газа в ячейке соударений (аргон) – 1.5 мТорр; разрешение квадруполяQ1 и Q2 составляло 0.7 и 1.2 FWHM, соответственно.

В качестве усушающегогаза использовали азот. Масс-спектрометр калибровали с использованием смеси1,3,6-политирозина. Для проверки работоспособности СВЭЖХ-МС/МС системыанализировали раствор 100 нг/мл MRFA перед каждой серией анализа.Обработку полученных данных производили с помощью комплексногопрограммного обеспечения Xcalibur версия 3.1.2.4.3 Синтез метаболитов GHRP в условиях in vitro2.4.3.1 Протеолитические ферментыМетаболиты исходных соединений получали инкубацией с различнымипротеолитическими ферментами в течение 24 ч при 37°С в соотношенияхфермент/субстрат 1:20, 1:50 и 1:100 (по весу).

Рабочая концентрация растворов60исходных соединений составляла 0.2 мкг/мл. Рабочие буферные растворыготовили согласно рекомендациям фирм-производителей ферментов (Таблица 6).Таблица 6 — Протеолитические ферменты и рабочие буферные растворы,использованные для протеолитического гидролиза GHRPСостав рабочих буферныхрастворовНаименование ферментаЧеловеческая рекомбинантнаяаминопептидаза N (rhAPN)Человеческая рекомбинантнаякарбоксипептидаза М (rhCPM)Бычья почечная микросомальнаялейциновая аминопептидаза (Leu-AP)Человеческая рекомбинантнаякарбоксипептидаза В (rhCPB) и бычьяпанкреатическая карбоксипептидаза В (CPB)50 мМ Tris-HCl (рН 7.0)50 мМ MES (рН 6.0)5 мМ CaCl20.2 М Na2HPO4 : 0.2 M NaH2PO4(2:7, об./об.)50 мМ Tris-HCl (рН 7.65)0.1 М NaCl25 мМ Tris-HCl (рН 8.85)1 мМ ЭДТАЭндопептидаза Lys CПолученные реакционные смеси разбавляли 2% раствором уксуснойкислоты и анализировали методом наноВЭЖХ-МСВР.

В качестве отрицательныхконтролейиспользовалиинкубационныесмесиисходныхпептидовбездобавления протеолитических ферментов.2.4.3.2 Человеческая сыворотка кровиДля получения пула сыворотки отбирали 8 мл крови у 10 здоровыхдобровольцев (5 мужчин и 5 женщин) из локтевой вены в специализированныевакуумныепробиркитипавакутейнерBD Vacutainer® SSTTM Advanceсактиватором свертывания и гелем-сепаратором, тщательно перемешивали,выдерживали не менее 30 мин при комнатной температуре для свертывания ицентрифугировали в течение 15 мин при 1 300 g.

Полученные образцы сывороткиобъединяли и хранили при температуре -80°С.Метаболиты GHRP получали инкубацией 1 мкг каждого пептида в 100 мклсыворотки крови человека в течение 24 ч при температуре 37°С и постоянномвстряхивании (400 об./мин). Для приготовления отрицательных контролей61использовали сыворотку человеческой крови после термической дезактивацииферментов при 95°С в течение 5 мин.

Полученные образцы до анализа хранилипри температуре -80°С. Перед анализом мажорные белки сыворотки кровиосаждали путем добавления к полученным реакционным смесям ацетонитрила всоотношении 1:4 (по объему), далее образцы центрифугировали в течение 10 минпри 14 000 g, полученные супернатанты упаривали при 45°С до конечного объема30-50 мкл.

Концентраты перерастворяли в 2% растворе уксусной кислоты,центрифугировали при 14 000 g в течение 5 мин и анализировали методомнаноВЭЖХ-МСВР.2.4.3.3 Субклеточные фракции фракцииМетаболиты пептидов получали инкубацией с каждой из in vitro систем втечение 24 ч при температуре 37°С и постоянном встряхивании (400 об./мин).Аликвота реакционной смеси включала 1 мкг пептида, 10 мкг белковсубклеточной фракции печени или почек человека в 100 мкл инкубационнойсмеси. В состав инкубационной смеси входили: НАДФН-регенерирующаясистема, состоящая из 42.5 мкг НАДФН, 19.5 мкг натриевой соли D-глюкозо-6фосфата, 15.5 мкг дрожжевой глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы со специфическойактивностью 200-400 ед./мг и 3.0 мМ хлорида магния в растворе ФСБ (рН 7.4).

Вкаждой серии экспериментов использовался свежие растворы компонентовНАДФН-регенерирующейсистемы,приготовленныеиз10-кратныхконцентрированных растворов.Очистку полученных образцов проводили аналогично экспериментам счеловеческойсывороткойкрови.Вкачествеотрицательныхконтролейанализировали реакционные смеси исходных пептидов без добавления аликвотысубклеточной фракции печени или почек.2.4.3.4 Рекомбинантная амидазаДеамидированныеметаболитысоединенийклассаGHRPполучалиинкубацией с рекомбинантной амидазой в течение 24 ч при температуре 30°С и62постоянном встряхивании (400 об./мин). Состав реакционный смеси включал:10 мкг исходного пептида, 50 мкг рекомбинантной амидазы в 500 мкл 100 мМбуферного раствора карбоната аммония (рН 7.4).

В качестве отрицательныхконтролей анализировали инкубационные смеси исходных пептидов бездобавления фермента.2.4.4 Пробоподготовка проб мочи методом ТФЭ2.4.4.1 Картридж Oasis®WCXС помощью индикаторной бумаги измеряли значения рН образцов мочи.При значениях 6.0 > рН > 6.5 в образцы мочи (1 мл) по каплям добавляли 0.2 МNaOH или 4% H3PO4, соответственно, при ручном доведении рН, либо 0.5 мл100 мМ раствора ФСБ к 0.5 мл мочи при доведении рН буферным раствором. Вовсе пробы добавляли по 5 мкл раствора внутренних стандартов (ВС1 и ВС2) доконечной концентрации 1 нг/мл.

В пробы контроля качества для построениякалибровочной прямой дополнительно вносили раствор контроля качества (QC), всостав которого входили все целевые пептиды и их метаболиты. Приготовленныепробы встряхивали на вихревом встряхивателе и центрифугировали при 14 000 gв течение 5 мин. Предварительно активировали картриджи Oasis®WCX 1 млметанола и 1 мл воды. Затем наносили пробы мочи, сорбент промывали 1 мл водыи 1 мл метанола. Элюцию связавшихся соединений проводили в пробирки LoBind1 мл 5% свежеприготовленным раствором муравьиной кислоты в метаноле.Скорость пропускания растворов составляла примерно 1 мл/мин. Пробыупаривали с использованием вакуумного упаривателя при температуре 45°С втечение 30-40 мин и минимальном давлении вакуумной системы до остаточногообъема 10-20 мкл жидкости. Полученные пробы перерастворяли в 50 мкл 2%водного раствора уксусной кислоты, встряхивали в течение 15-20 сек ицентрифугировали при 14 000 g в течение 5 мин.

Экстракты переносили в виалыдля последующего СВЭЖХ-МС/МС анализа.632.4.4.2 Картриджи Oasis®HLBВ образцы мочи добавляли 5 мкл раствора внутренних стандартов (ВС1 иВС2) и 5 мкл контроля качества (QC), в состав которого входили все целевыепептиды. Приготовленные пробы встряхивали на вихревом встряхивателе ицентрифугировали при 14 000 g в течение 5 мин. Картриджи Oasis®HLBпредварительно активировали 2 мл метанола и 2 мл воды, далее наносили пробымочи, сорбент промывали 2 мл воды.

Элюцию связавшихся соединенийпроводили в пробирки LoBind 1.4 мл смеси ацетонитрил/вода (80/20, об./об.).Скорость пропускания растворов составляла примерно 1 мл/мин. Дальнейшуюпробоподготовкуобразцовпроводилианалогичновышеприведенномупротоколу.2.4.4.3 Планшеты для микроэкстракцииК 0.25 мл мочи добавляли 0.25 мл 200 мМ раствора ФСБ (pH 6.5) и 2.5 мклраствора внутренних стандартов (ВС1 и ВС2) до конечной концентрации 1 нг/мл.Впробыконтролякачествадляпостроениякалибровочнойпрямойдополнительно вносили раствор контроля качества (QC), в состав котороговходили все целевые пептиды и их метаболиты. Приготовленные пробывстряхивали на вихревом встряхивателе и центрифугировали при 14 000 g втечение 5 мин.

Далее проводили ТФЭ с использованием планшетов длямикроэкстракции Oasis®WCX, которые предварительно активировали 0.2 млметанола и 0.2 мл воды. Затем наносили разбавленные пробы мочи, сорбентпромывали 0.2 мл воды и 0.1 мл метанола. Элюцию связавшихся соединенийпроводили в специальные 96-луночные резервуары 70 мкл (35 мкл ×2) 5%свежеприготовленным раствором муравьиной кислоты в метаноле. К полученнымэлюатам добавляли по 30 мкл 2% водного раствора уксусной кислоты,встряхивали в течение 15-20 сек и переносили в виалы для последующегоСВЭЖХ-МС/МС анализа.ДляразработалидополнительногопротоколТФЭконцентрированиянапланшетах64анализируемыхдляобразцовмикроэкстракциисконцентрированием в токе азота.

Элюцию связавшихся соединений проводили вспециальные96-луночныерезервуары0.3 мл(0.15 мл ×2 )5%свежеприготовленным раствором муравьиной кислоты в метаноле. Пробыупаривали под током азота течение 20-30 мин до остаточного объема 5-10 мклжидкости. Полученные пробы перерастворяли в 50 мкл 2% водного растворауксусной кислоты и встряхивали в течение 15-20 сек. Полученные супернатантыпереносили в виалы для последующего СВЭЖХ-МС/МС анализа.2.4.5 Пробоподготовка проб сыворотки крови2.4.5.1 ТФЭК 0.2 мл сыворотки крови добавляли 2 мл воды и 5 мкл раствора ВС,содержащего по 1 нг ВС1 и ВС2. В пробы контроля качества дополнительновносили 5 мкл раствора контроля качества, содержащих 1 нг GHRP-2 и GHRP-6.Приготовленные пробы встряхивали и центрифугировали при 14 000 g в течение5 мин.ЗатемпроводилиТФЭнакартриджахOasis®HLB,дляэтогопредварительно картриджи активировали 2 мл метанола и 2 мл воды.

Далеенаносили пробы сыворотки и промывали сорбент от неспецифически связавшихсясоединений 2 мл воды. Элюцию связавшихся соединений проводили в пробиркиLoBind объемом на 1.5 мл раствором ацетонитрил/вода/муравьиная кислота80/15/5 (об./об./об.). Скорость пропускания растворов составляла примерно 1мл/мин. Пробы упаривали с использованием вакуумного упаривателя притемпературе 45оС в течение 30-40 мин и минимальном давлении вакуумнойсистемы до остаточного объема 10-20 мкл жидкости. Полученные пробыперерастворяли в 100 мкл раствора вода/ацетонитрил/муравьиная кислота 99/1/0.2(об./об./об.), встряхивали в течение 15-20 сек и центрифугировали при 14 000 g втечение 5 мин, полученные супернатанты переносили в виалы для последующегоСВЭЖХ-МС/МС анализа.652.4.5.2 Преципитацией органическим растворителемК 0.1 мл сыворотки крови добавляли 0.1 мл воды и 5 мкл раствора ВС,содержащего 1 нг ВС1 и ВС2.

Для построения калибровочной кривой в пробыконтроля качества дополнительно вносили 0.5, 1.0, 2.0 и 2.5 нг GHRP-2, GHRP-6 и1.0, 2.0, 4.0 и 5.0 нг GHRP-2 (1-3) ОН. Приготовленные пробы встряхивали, затемдля очистки от мажорных ткане-специфических белков человеческой кровиразбавляли ацетонитрилом в соотношении 1:4 (по объему), встряхивали в течение30-40 сек и центрифугировали при 14 000 g в течение 10 мин.

Полученныесупернатанты переносили в новые пробирки и упаривали при температуре 45оС иминимальном давлении вакуумной системы до остаточного объема 10-20 мклжидкости. Полученные пробы перерастворяли в 50 мкл 2% водного растворауксусной кислоты, встряхивали в течение 15-20 сек и центрифугировали при14 000 g в течение 5 мин. Полученные супернатанты переносили в виалы дляпоследующего СВЭЖХ-МС/МС анализа.2.4.6 Изучение метаболитов GHRP в образцах мочи и сыворотки кровипосле приема препаратов здоровыми добровольцами2.4.6.1 Определение метаболитов GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, гексарелина иипаморелина в образцах мочи после назального приемаВ исследовании принимали участие 5 здоровых добровольцев мужскогопола, средние показатели возраста и веса которых составили 39.6±9.9 лет и90±14.7 кг, соответственно.