Диссертация (Прогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля), страница 7

Повышенная протеолитическаяустойчивость пептоидов к ферментам, более высокая проницаемость черезбиологические мембраны и большее разнообразие возможных конформаций посравнению с пептидами делают их привлекательными для фармакологическойиндустрии [102].Данные по метаболизму пептоидов ограничены, возможно, ввиду тольконедавнего возрождения интереса к ним в качестве возможных терапевтическихпрепаратов [103].

В работах [104,105] приведены сведения по сравнениюстабильности гомологичных L-пептидов, D-пептидов, пептоидов и ретропептоидов при инкубации с аминопептидазой А, папином, пепсином, эластазой,химотрипсином и трипсином. Последовательности синтезированных пептидовбыливыбраныраспознаваниямисучетомпротеазами,минимальнойчтоделаетнеобходимойэтипептидыдлинысайтовудобнымидляисследования объектами в качестве субстратов и/или ингибиторов для каждого изпротеолитических ферментов (Рисунок 9).33Карбоксипептидаза А12 ―3―412 ―3―4―Ac-Ala ― Tyr ― Ala ― PheПапаин5—65―6Ac-Ala ― Phe ― Glu ― Leu — Ala — Ala-NH2Пепсин2 ―13―4 ―Cbz-Ala ― His ― Phe ― Phe ― Arg ― Leu-NH2Трипсин2 ―3―4―5—612 ―3―4 ―5―612 ―3―4 ―5―61Ac-Phe ― Ala ― Arg ― Ala — Arg — Asp-NH2ХимотрипсинAc-Ala ― Leu ― Phe ― Ala ―Leu ― Arg-NH2ЭластазаAc-Ala ― Ala ― Ala ― Leu ― Phe ― Arg-NH2Рисунок 9 — Последовательности L-пептидов, D-пептидов, пептоидов и ретропептоидов в экспериментах при инкубации с различными протеолитическимиферментами [104,105]Согласно данным работподвергалисьгидролизу[104,105], все синтезированные L-пептидывсемииспользованнымипротеолитическимиферментами.

Среди пептоидов и ретро-пептоидов было показано полноеотсутствие расщепления [105,106]. Стабильность пептоидов in vivo так жеподтверждается результатами исследования основных фармакокинетическиххарактеристик трипептоида и тетрапептида с аналогичной структурой пептидногоостова при пероральном способе приема и внутривенных инъекциях крысам[107]. Оба соединения быстро выводились из организма, но разными путями:тетрапептид экскретировался в виде метаболитов, трипептоид – в неизмененномвиде с мочой и, в большой степени, с желчью.341.5.2.3 Соединения с модификациями пептидной связи (amide bondsurrogates)Соединения с модификациями пептидной связи (amide bond surrogates)представляют собой соединения, в которых одна или более амидных связейзаменены другими различными химическими группами, для обозначения заменкоторых применяется так называемая номенклатура «psi-скобок» [91,108]. Разныезаместительные группы обладают различными свойствами (Таблица 2).Таблица 2 — Некоторые заместительные группы и их свойства [109]ЗаменаСвойстваΨ(СН=СН) Относительно липофильная замена, конформационно близкая потопологии амидной связи, ограниченные возможности дляобразования водородной связи в виде донора/акцептора.Ψ(CSNH) Чувствительная/тонкая(subtle)модификация,данныеконформационныхисследованийпредполагаютбольшиевозможности Ψ[CSNH], чем классической амидной в качестве донорапри образовании водородной связи.Ψ(CH2S)Гибкая, липофильная, не участвующая в образовании водороднойсвязи модификация.

При окислении в мягких условиях могутполучаться оптически разные сульфоксиды, которые часто обладаютразличной биологической активностью.Ψ(CH2NH) Гидрофильная, гибкая модификация амидной связи, сохраняющаяспособность быть донором водородной связи.Ψ(NHCO) Ретро – инверсо амидная связь.Помимо увеличения стабильности соединений замена амидной связи можетсказываться на функциональной активности молекул, как это было показано дляаналогаэнкефалинаΨ(СН2―SH)иоктапептидаингибитораренинаΨ(СН2―NH) [91].Данные по изменению протеолитической стабильности гонадолиберина иего аналогов при замене пептидной связи Ψ(СН=СН) между аминокислотнымиостатками Tyr5―Gly6, Gly6―Leu7 и Pro9―Gly10 представлены в статье [110].Показано, что при инкубации LHRH и трех его аналогов-псевдопептидов схимотрипсином происходит быстрое расщепление связи Trp3―Ser4 среди всех35соединений и незащищенной пептидной связи Tyr5―Gly6 у соединений LHRH и[Pro9ΨGly10]LHRH.НаРисунке10схематичнопредставленыпродуктыдеградации гонадолиберина и его аналогов.Гонадолиберин, LHRH1химотрипсин2 ―3―4―τ1/2, минсубтилизинхимотрипсин5—67—8—9химотрипсинсубтилизин10Pyr ― His ― Trp ― Ser ― Tyr — Gly — Leu — Arg— Pro — Gly-NH2/<0.1 / <0.1[Tyr5-Ψ-Gly6]LHRH1субтилизинхимотрипсин2 ―3―субтилизин4―57—68—910Pyr ― His ― Trp ― Ser ― Tyr-Ψ-(E,CH=CH)- Gly — Leu — Arg — Pro —Gly-NH2<0.1 / 1260[Gly6-Ψ-(D,L-Leu)7]LHRHхимотрипсин12 ―3―4―субтилизин5—678—910Pyr ― His ― Trp ― Ser ― Tyr — Gly-Ψ-(E,CH=CH)- Leu —Arg— Pro — Gly-NH2[Pro9-Ψ-Gly10]LHRH1химотрипсин2 ―3―4―субтилизинхимотрипсин5—678—9<0.1 / 910Pyr ― His ― Trp ― Ser ― Tyr — Gly — Leu — Arg— Pro-Ψ-(E,CH=CH)-Gly-NH2<0.1 / <0.1Рисунок 10 — Структура гонадолиберина и его аналогов [Tyr5-Ψ-Gly6]LHRH,[Gly6-Ψ-(D,L-Leu)7] LHRH, [Pro9-Ψ-Gly10]LHRH с указанием сайтов расщепления ивремени полураспада при инкубации с химотрипсином и субтилизином [110].Обозначения: Ψ(Е, СН=СН) – изостерическая замена Ψ(СН2-СН2) вместоΨ(СН2―NН)Субтилизин специфичен к пептидной связи Tyr5―Gly6, однако включениезвена Ψ(СН=СН) в структуру соединения [Gly6-Ψ-(D,L-Leu)7] LHRH значительноповышаетстабильностьизостерическаязаменамодифицированногосвязиΨ(СН2―NН)пептида.Такимспособствуетобразом,увеличениюстабильности замещаемой и соседних связей LHRH в эксперименте схимотрипсином, но часто недостаточна при дизайне полностью устойчивойструктуры к специфическим протеазам.1.2.3 Изменение N- и C-концевых частей молекулыМногие протеолитические ферменты крови являются экзопептидазами(карбоксипептидазами и аминопептидазами), которые расщепляют белки и36пептиды с С- и N-конца, соответственно [41].

Для увеличения стабильностипептидов и белков часто применяют модифицирование или включениеаминокислот, более устойчивых к экзопептидазам, в концевых частях молекулы.Известно, что N-концевая аминокислота оказывает существенное влияние настабильность соединения в плазме. Пептиды, содержащие остатки Met, Ser, Ala,Thr, Val и Gly на N-конце, характеризуются большим периодом полураспада присравнении с пептидами, у которых N-концевая аминокислота представляет собойPhe, Leu, Asp, Lys или Arg. Одними из наиболее распространенных концевыхмодификаций является N-ацилирование и С-амидирование.1.5.4.1 С-амидированиеС-амидирование представляет собой замену С-концевой карбоксильнойгруппы на амидную [111]. В природе амидирование С-концевых аминокислотныхостатков широко распространено у высших эукариот, в живых организмах этотпроцесспроисходитферментативнымконцевогоN-окислениемостаткапрогормона под воздействием ферментов пептидилглицин-α-амидирующеймонооксигеназы и пептидил-α-гидроксиглицин α-амидирующей лиазы [112].Амидирование препятствует С-концевой ионизации, что делает соединениеболее гидрофобным и положительно сказывается на связывании с рецептором[111].

Большая часть гормонов пептидной природы имеют модифицированный Сконец, необходимый для их полноценной активности: substance Р, нейропептид Y,окситоцин, вазопрессин, гастрин и так далее, также эта модификация встречаетсяв структуре многих конотоксинов, противомикробных пептидов. Помимоусиления биоактивности, одной из его функцией является защита С-концамолекулы от экзопептидаз, что увеличивает устойчивость соединений пептиднойприроды [113].ДезамидированиеС-концевойамиднойгруппыпредставляетсобойтриггерное значение в метаболической деградации соединений с подобноймодификацией.

Например, метаболизм антагониста G со структурой Arg―(DTrp)―(N-Me)Phe―(D-Trp)―Leu―Met-NH237инициируетсяферментативнымдезамидированием С-концевого аминокислотного остатка с образованиемметаболита Arg―(D-Trp)―(N-Me)Phe―(D-Trp)―Leu―Met-ОН, который затемподвергается воздействию карбоксипептидазы с образованием метаболитаArg―(D-Trp)―(N-Me)Phe―(D-Trp)―Leu-ОН [82]. Сообщено онесколькихферментах, осуществляющих дезамидирование, сериновая карбоксипептидазасреди них является наиболее распространенной [82,114,115].Все представители класса GHRP включают С-концевую амидную группу,котораязащищаетфункциональнуюсоединенияроль,придаваяоткарбоксипептидаздополнительныйивыполняетположительныйзарядмолекуле, необходимый для лучшей аффиности к грелиновому рецептору.

Вработах [116,117] описаны метаболиты, полученные в процессе инкубации сферментами рекомбинантой амидазой и химотрипсином, соответственно. Однакодеамидированные метаболиты в экспериментах in vivo и in vitro с субклеточнымифракциями не выявлены.В фармакологической промышленности около 50% всех терапевтическихпрепаратовпептиднойприродывкачествеС-концевойзащитнойифункциональной группы имеют амидную группу [118]. N-ацилирование СООНкарбоксиамидной группы – новая стратегия увеличения стабильности игидрофобности пептидных соединений, которая была применена при разработкеаналогов гонадолиберина, например, молекула трипторелина имеет С-концевуюэтил-амидную группу [119].1.5.4.2 N-ацилированиеN-ацилирование представляет собой процесс присоединения карбоксильнойгруппы остатка жирной кислоты к аминогруппе аминокислотного остатка, какправило, модифицируют α-аминогруппу N-концевой аминокислоты, однакоизвестны случаи и С-концевого ацилирования.

Данная модификация ужерассматривалосьвышепризаменепроизводные.38аминокислотнаN-ацилированныеПомимовведениястерическихпрепятствийвсайтахузнаванияпротеолитических ферментов, ацилирование нестабильных белков и пептидовиспользуется для их нековалентного присоединения к альбумину. Человеческийсывороточный альбумин имеет молекулярную массу около 67 кДа и являетсянаиболее распространенным белком сыворотки крови, период полураспадакоторого составляет 19 дней.