Диссертация (Прогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля)

Федеральное государственное бюджетное учреждение«Антидопинговый центр»На правах рукописиЗверева Ирина ОлеговнаПрогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона ростав организме человека для разработки методики их определенияв целях антидопингового контроля02.00.10 – биоорганическая химия02.00.02 – аналитическая химияДиссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукНаучные руководители:к.б.н. Кротов Г.И.к.х.н., доц. Ефимова Е.А.Москва – 2017СодержаниеВведение ........................................................................................................................... 5Цели и задачи исследования ..........................................................................................

7Научная новизна работы................................................................................................. 8Теоретическая и практическая значимость работы ..................................................... 9Положения, выносимые на защиту ............................................................................. 10Степень достоверности и апробация работы ............................................................. 10Личный вклад автора ....................................................................................................

10Структура и объем работы ........................................................................................... 10Глава 1. Литературный обзор ....................................................................................... 111.1 Гормон роста и его секретагоги.......................................................................... 111.1.1 Физиологическое значение гормона роста.................................................. 121.1.2 Заболевания, связанные с нарушением секреции гормона роста .............

131.1.3 Грелин и его рецептор ................................................................................... 141.1.4 Рилизинг-пептиды гормона роста ................................................................ 151.2 Особенности метаболизма химически-модифицированных и синтетическихбелков и пептидов ...................................................................................................... 191.2.1 Замена аминокислот (использование D-, β- и ненатуральныхаминокислот) ...........................................................................................................

201.2.2 Замена пептидной связи (псевдопептиды) .................................................. 291.2.3 Изменение N- и C-концевых частей молекулы ........................................... 361.3 Методы изучения метаболизма соединений пептидной природы ..................

401.3.1 Биологические модели изучения метаболизма ........................................... 401.3.2 Аналитические подходы идентификации метаболитов ............................. 421.4 Методы определения GHRP и их метаболитов в допинг-контроле ............... 451.4.1 Хроматомасс-спектрометрические методы ................................................

451.4.2 Метод конкурирующего связывания лигандов с рецептором грелина .... 54Глава 2. Экспериментальная часть .............................................................................. 562.1 Химические реактивы и материалы ................................................................... 562.2 Основное оборудование ...................................................................................... 572.3 Вспомогательное оборудование ......................................................................... 5822.4 Методика эксперимента ......................................................................................

582.4.1 наноВЭЖХ-МСВР анализ GHRP и их метаболитов .................................. 582.4.2 СВЭЖХ-МС/МС анализ GHRP и их метаболитов ..................................... 602.4.3 Синтез метаболитов GHRP в условиях in vitro ........................................... 602.4.4 Пробоподготовка проб мочи методом ТФЭ................................................ 632.4.5 Пробоподготовка проб сыворотки крови .................................................... 652.4.6 Изучение метаболитов GHRP в образцах мочи и сыворотки крови послеприема препаратов здоровыми добровольцами...................................................

66Глава 3. Результаты и обсуждения .............................................................................. 693.1 Сравнение различных in vitro и in vivo моделей метаболизма синтетическихдопинговых соединений пептидной природы......................................................... 693.1.1 Протеолитические ферменты ....................................................................... 693.1.2 Сыворотка человеческой крови .................................................................... 783.1.3 Субклеточные фракции ................................................................................. 843.1.4 Выбор оптимальной in vitro модели моделирования процессовбиотрансформации пептидных соединений в организме человека ................... 943.1.5 Идентификация in vivo метаболитов GHRP в моче человека посленазального приема пептидов GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, гексарелина иипаморелина ............................................................................................................

953.2 Разработка и валидация методики определения GHRP и их метаболитов впробах мочи методом СВЭЖХ-МС/МС ................................................................ 1013.2.1 Выбор сорбента для ТФЭ ............................................................................ 1013.2.2 Выбор способа доведения рН .....................................................................

1053.2.3 Валидация методики определения GHRP и их метаболитов в пробахмочи методом СВЭЖХ-МС/МС .......................................................................... 1073.3 Апробация методики определения GHRP и их метаболитов в пробах мочиметодом СВЭЖХ-МС/МС ....................................................................................... 1123.3.1 Количественная оценка наиболее интенсивных и долгоживущихметаболитов GHRP в образцах мочи ..................................................................

1123.3.2 Оценка влияния особенностей метаболизма на биотрансформациюсоединений после назального и внутривенного введения GHRP-2 и назальногоприема GHRP-6 ..................................................................................................... 115Заключение ..................................................................................................................

1253Выводы ......................................................................................................................... 128Благодарности .............................................................................................................. 130Список условных обозначений и сокращений ......................................................... 131Список литературы ..................................................................................................... 135Приложение ................................................................................................................. 1584ВведениеВ современном мире год от года растет значение побед на крупнейшихмеждународныхспортивныхтурнирах.Победаявляетсянетолькопрофессиональной целью атлетов, но и входит в интересы государства длядемонстрации превосходства, мощи и национального престижа [1].

Радидостижения высоких спортивных результатов используются самые последниенаучныеразработкидляпроизводства:одежды,спортивныхснарядов,специального питания и эксклюзивных медицинских препаратов [2]. Одним изостро стоящих вопросов современного спорта является применение допинга. Отспортсменов, с одной стороны, требуют высоких результатов, а с другой стороны,соблюдения правил честной игры (Fair-play), игры без допинга. На фонеужесточенияантидопинговыхантидопинговогоагентстваправил(ВАДА)ЗапрещенныйежегодносписокпополняетсяВсемирноговсеновымивеществами и методами.Гормон роста (ГР) является одним из «скандально» известных допинговыхпрепаратов.

Увеличение концентрации ГР способствует росту мышечной икостной ткани, уменьшению жировой прослойки, ускоренному заживлению ран иускорению восстановления работоспособности [3]. Перспективы использованияГР в качестве допинга описаны еще в 1982 году Даном Дюшаном в публикации«Wow – GH is amazing» в книге «Подпольное руководство по стероидам»(«Underground Steroid handbook», Dan Duchaine).

После нескольких инцидентовприема препаратов ГР, он включен в Запрещенный список в 1989 году, несмотряна отсутствие официально принятого метода определения [3,4]. ГР, как и вселекарственныепрепаратыпептиднойприроды,характеризуетсяпротеолитической нестабильностью и низкой биодоступностью, поэтому начинаяс конца XX столетия активно ведутся поиски его аналогов с более простойхимической структурой [5].

Подобными аналогами являются соединения классарилизинг-пептидов гормона роста (GHRP, от англ. Growth hormone releasingpeptides), которые способствуют увеличению концентрации ГР путем стимуляцииего выработки. GHRP включены в Секцию S2 «Пептидные гормоны, факторы5роста, подобные субстанции и миметики» Запрещенного списка ВАДА и должныопределяться антидопинговыми лабораториями. Для идентификации GHRPразработаны методики с использованием высокоэффективной жидкостнойхроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) иконкурирующего связывания в присутствии изотопно меченого природногоагониста грелина (125I-грелин) с рецептором GHS-Ra1, экспрессированного наповерхности клеток HEK-293 [6–9].

В современном антидопинговом контролеприменяетсяселективностью,методВЭЖХ-МС/МС,чувствительностью,характеризующийсяэкспрессностью,высокойнадежностьюиинформативностью, позволяя определять большое количество соединений в ходеодного анализа. Помимо интактных молекул метод позволяет детектироватьметаболиты, что особенно актуально для препаратов пептидной природы ввидуих быстрой деградации в организме человека, часто настолько стремительной, чтоисходное соединение не детектируется в биологических жидкостях уже через 24 чпосле приема.Скоростьвыведенияобразовавшихсяметаболитовможетзначительно превышать время выведения исходных субстанций, поэтомувключение их метаболитов в скрининговые методики может увеличивать окнодетектирования после приема допинга и достоверность их идентификации [5].Однако, в большинстве случаев информация о путях биотрансформации вчеловеческом организме рилизинг-пептидов гормона роста ограничена в виду ихстатуса неразрешенных к приему препаратов.