Диссертация (Прогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля), страница 9

В его основе лежит измерение соотношения массык заряду (m/z) ионов в газовой фазе. Изначально он использовался дляидентификации только небольших термостабильных молекул. С разработкойметодов «мягкой ионизации», среди которых электрораспылительная ионизация(ЭРИ), химическая ионизация при атмосферном давлении (ХИАД), матричноактивированная лазерная дерсорбция/ионизация (МАЛДИ), стало возможно массспектрометрическое определение соединений пептидной природы [5,144–146].Соединение технологий жидкостной хроматографии (ЖХ) и МС обеспечилозначительный прогресс в чувствительности биоанализа белков и пептидов, аметод ЖХ-МС стал основным для идентифицирования подобных соединений[5,139].МС подход обладает высокими специфичностью и селективностью, егоиспользование позволяет получить детальную информацию об аминокислотнойпоследовательности, наличии и виде химических и/или посттрансляционныхмодификаций, таких как гликозилирование, ацилирование, амидирование идругих.

Для обработки полученных масс-спектров разработаны многочисленныепрограммы сбора дополнительной информации об анализируемом соединенииили его фрагменте, например, о его принадлежности к какому-либо белку,близкородственных белках и так далее. Однако масс-спектрометрическоедетектирование образовавшихся метаболитов не всегда может полностьюохарактеризовать их строение [5]. В подобных случаях для определениях ихструктуры наряду с подходом МС используются различные аналитические иметоды «мокрой» химии («Wet chemistry») такие, как ЖХ-ЯМР, ферментативныйгидролиз, химическая дериватизация и обмен водорода на дейтерий [139].441.4 Методы определения GHRP и их метаболитов в допинг-контролеК настоящему времени для идентификации GHRP в целях антидопинговогоконтроля предложены методы ЖХ-МС и конкурирующего связывания вприсутствии изотопно меченого природного агониста грелина (125I-грелин) срецептором GHS-Ra1, экспрессированного на поверхности клеток HEK-293.1.4.1 Хроматомасс-спектрометрические методыДлявыявленияфактовзлоупотреблениявGHRPсовременномантидопинговом контроле применяется хроматомасс-спектрометрические методы,характеризующиесявысокойселективностью,чувствительностью,экспрессностью, надежностью и информативностью, позволяя определятьбольшое количество соединений в ходе одного анализа, в том числе и метаболитыизвестной структуры.В одной из первых работ [147] авторами японской антидопинговойлаборатории представлены данные по идентификации GHRP-2 и его метаболитаGHRP-2 (1-3) OH в моче человека методом высокоэффективной жидкостнойхроматографии в сочетании с тройным квадрупольным масс-анализатором(ВЭЖХ-МС/МС).

В качестве внутреннего стандарта использовали изотопномеченый GHRP-2, при апробации методики анализировали образцы мочи десятиволонтеров мужского пола, собранные после однократного внутривенного приема100 мкг препарата.Для очистки и концентрирования пептидов проводили твердофазнуюкстракцию (ТФЭ) с применением картриджей Oasis®HLB после разбавленияобразцовмочи2 М глициновымхроматографическогоразделениябуфернымиспользовалираствором(рН 2.2).аналитическуюДляколонкуAcquity UPLC® BEH C18 (2.1 × 50 мм, размер частиц 1.7 мкм).

В качествеподвижных фаз применяли 0.1% раствор трифторуксусной кислоты в воде (А) иметаноле (В). Программа для разделения компонентов смеси была следующей: 0мин – 10% (В), 1 мин – 40% (В), 8 мин – 35% (В), 9 мин – 80% (В), 9.1 мин – 10%(В), 11.1 мин – 10% (В). Скорость потока – 0.5 мл/мин, объем образца – 10 мкл.45Идентификацию соединений проводили с использованием масс-спектрометраTQD фирмы Waters Inc. в режиме положительной ионизации. Сбор данныхосуществляли в режиме мониторинга селективных реакций (SRM – selectedreaction monitoring). Для детектирования GHRP-2 авторы выбрали следующиеионные переходы: m/z 410→241, 410→170, 410→269, 410→550, 410→129 и410→170 (для количественной оценки) с энергиями коллизии 15 и 26 эВ дляпоследнего, соответственно.

Для детектирования GHRP-2 (1-3) OH выбраныследующие характеристичные переходы: m/z 358→241, 358→170, 358→269,358→198, 358→287 и 358→170 (для количественной оценки) с энергиямиколлизии 15 и 28 эВ для последнего, соответственно. Ионный переход дляизотопно меченого GHRP-2 был 415→170 при энергии коллизии 24 эВ.Предложенныйхарактеризуетсяспособлинейностью(y=0.1017x+0.0238приопределениявr=0.9992диапазонеиGHRP-2иегоконцентрацийy=0.3163x+0.0338метаболита0.5–10принг/млr=0.9986,соответственно). Пределы обнаружения GHRP-2 и GHRP-2 (1-3) OH составили0.05 и 0.02 нг/мл, степень извлечения варьировалась от 84 до 101%.Значительного влияния компонентов матрицы на ионизацию соединений необнаружено.

Прецизионность в условиях одного дня и между днями составила1.6–3.8% и 1.9–4.3, соответственно.Авторами немецкой антидопинговой лаборатории [148] разработанаметодика определения GHRP-2 и гексарелина в образцах плазмы крови сиспользованием изотопно меченого соединения непептидной природы 2H3-S107 вкачествевнутреннеговысокоэффективнойстандартажидкостнойметодомсверхвысокопроизводительнойхроматографиивсочетаниисмасс-спектрометрией высокого разрешения (СВЭЖХ-МСВР).Очисткуиконцентрированиецелевыхсоединенийпроводилипреципитацией мажорных ткане-специфичных белков, добавляя к 50 мкл образца100 мкл ацетонитрила.

После центрифугирования в течение 3 мин при 17 000 gсупернатанты упаривали, полученные концентраты перерастворяли в 50 мклсмеси ацетонитрил/вода (10/90, об./об.) и анализировали методом СВЭЖХ-МСВР.46Хроматографическое разделение компонентов осуществляли на аналитическойколонке Hypersil Gold® C18 (2.1 × 50 мм, размер частиц 1.7 мкм) по следующейпрограмме: 1 мин – 1% (В), 12 мин – 100% (В), 12.5 мин – 100% (В), 14 мин – 1%(В). Водный раствор 0.1% муравьиной кислоты (А) и ацетонитрил (В)применялись в качестве подвижных фаз при скорости потока 0.2 мл/мин, объемобразца – 5 мкл.

Масс-спектрометрическое детектирование пептидов проводили сиспользованием масс-спектрометра высокого разрешения модели Exactive фирмыThermo в условиях ЭРИ с регистрацией положительных ионов. Сбор данныхпроводился в режимах сканирования по полному ионному току с разрешением50 000 на ширине половины высоты максимума (FWHM) в диапазоне массm/z 100-1000 и мониторинга ионов-прекурсоров с разрешением 25 000 FWHM вдиапазоне масс m/z 70-600.

В качестве ионов-прекурсоров GHRP-2 и гексарелинавыбрали ионы [M+2H]2+ со значениями m/z 409.7206 и 444.2367, соответственно.ДанныйспособопределенияGHRP-2игексарелинавплазмехарактеризуется линейностью в диапазоне концентраций 10–100 нг/мл скоэффициентами корреляции r=0.990 и r=0.997, соответственно. Степеньизвлечения и прецизионность в условиях одного дня составили 18.3–18.4% и88.6–87.6%, соответственно. При оценке надежности методики коэффициенткорреляции составил менее 0.9, что является удовлетворительным. Значительноговлияния компонентов матрицы на ионизацию соединений не обнаружено.Несколько позже авторы разработали методику для определения 8 наиболеераспространенныхGHRP в моче с использованием двух изотопно меченыхстандартов (GHRP-2 (1-3) OH и GHRP-4) методом СВЭЖХ-МСВР [7].

Приапробации методики анализировали образцы мочи одного волонтера мужскогопола, собранные после однократного перорального приема 10 мг GHRP-2.Для очистки и концентрирования пептидов проводили ТФЭ с применениемкартриджей Phenomenex® STRATA-XCW после доведения рН образцов мочи дозначения 7.0 добавлением 2% раствора фосфорной кислоты или 0.02 М растворагидроксида натрия (при необходимости). Для хроматографического разделенияиспользовали аналитическую колонку Hypersil Gold® C18 (1 × 50 мм, размер47частиц 1.9 мкм) по следующей программе: 0 мин – 5% (В), 8 мин – 35% (В), 10мин – 80% (В), 15 мин – 5% (В) при скорости потока – 120 мкл/мин.

Составмобильных фаз был аналогичен предыдущей методике, объем образца – 10 мкл.Идентификацию пептидов проводили с использованием масс-спектрометравысокого разрешения модели LTQ Orbitrap фирмы Thermo в режимах регистрациипо полному ионному току и мониторинга ионов-продуктов, образовавшихся врезультате диссоциации, активируемой соударениями, наиболее интенсивныхионов-прекурсоров при разрешении 30 000 FWHM. Анализ образцов мочипроводили с использованием масс-спектрометра модели Exactive фирмы Thermo врежимах сканирования по полному ионному току с разрешением 50 000 FWHM вдиапазоне масс m/z 300-1000 и мониторинга ионов-продуктов с разрешением25 000 FWHM в диапазоне масс m/z 100-1000 при энергии коллизии 25 и 40 эВ(Таблица 3).Таблица 3 ― Ион-прекурсоры определяемых соединенийСоединениеGHRP-1GHRP-2GHRP-2 (1-3) OHGHRP-4GHRP-5GHRP-6алексаморелингексарелинипаморелин[2H3]Ala3-GHRP-2 (1-3) OH (ВС1)[2H4]Ala2-GHRP-4 (ВС2)Ион-прекурсор, m/z478.32+409.72+358.2+608.3+771.3+437.22+479.82+444.22+356.72+612.3+361.2+Предложенный способ определения GHRP в моче человека характеризуетсялинейностью в диапазоне концентраций 0–10 нг/мл с коэффициентамикорреляции от r=0.9955 до r=0.9997, соответственно.