Диссертация (Прогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля), страница 13

Волонтеры заранее были проинформированы обо всехдеталях эксперимента, после чего каждым волонтером было подписанописьменное согласие на участие в исследовании. Протокол эксперимента былодобрен Комиссией по биомедицинской этике Министерства спорта РоссийскойФедерации.Каждому волонтеру назально вводили один из исследуемых пептидов(GHRP-1, GHRP-2, GHRP-6, гексарелин или ипаморелин) в концентрации 5 мкг на1 кг веса, перерастворенного в 200 мкл воды для инъекций. Образцы мочиотбирали до введения пептидов (пробы бланковой мочи) и в течение 48 ч после66приема.

Образцы мочи аликвотировали и хранили при температуре -20°C доанализа. Для длительного хранения образцы мочи помещали в морозильник при-80°С.2.4.6.2 Определение метаболитов GHRP-2 и GHRP-6 в образцах сывороткикрови после назального приемаВ исследовании принимали участие 6 здоровых добровольцев мужскогопола, средние показатели возраста и веса которых составили 38.8±8.0 лет и81.8±20.5 кг, соответственно. Волонтеры заранее были проинформированы одеталях эксперимента, после чего каждым волонтером было подписанописьменное согласие на участие в исследовании.Двум волонтерам назально вводили исследуемый пептид GHRP-2 вколичестве 500 мкг, перерастворенного в 200 мкл воды для инъекций, двумволонтерам – GHRP-6 в аналогичном количестве. Два волонтера входили в составконтрольной группы. Образцы крови отбирали до введения пептидов (пробыбланковой сыворотки) и через 30 мин, 1, 2, 4, 8 и 24 ч после приема препаратов.Образцы сыворотки крови получали, согласно выше представленному описанию.Образцы сыворотки аликвотировали и хранили при температуре -80°C до анализа.2.4.6.3 Определение метаболитов GHRP-2 в образцах сыворотки крови имочи после внутривенного приемаОбразцы сыворотки крови после единовременного внутривенного введенияGHRP-2 здоровым добровольцам были предоставлены испанской антидопинговойлабораторией Barcelona Antidoping Laboratory института Fundació Institut MarD'Investigacions Mèdiques (IMIM) в г.

Барселона, Испания.В исследовании принимали участие 10 здоровых добровольцев мужскогопола в возрасте от 20 до 30 лет, средние показатели индекса массы тела и весакоторых составили 21.5±3.5 кг/м² и 72.9±8.7 кг, соответственно. Волонтерызаранее были проинформированы о деталях эксперимента, после чего каждымволонтером было подписано письменное согласие на участие в исследовании.67ПротоколэкспериментабылодобренЭтическимкомитетомнаучныхисследований Parc Salut Mar в г. Барселона (n°2014/5760).Восьмиволонтерамвнутривенновводилирастворпралморелинадигидрохлорида (GHRP-2, торговое название GHRP KAKEN100®, KakenPharmaceutical Co., Ltd) в количестве 100 мкг в виде раствора для инъекции.

Дваволонтера входили в состав контрольной группы. Образцы крови отбирали довведения пептидов (пробы бланковой сыворотки) и через 30 мин, 1, 1.5, 2, 3, 4, 8 и24 ч после приема препарата. Образцы сыворотки аликвотировали и хранили при-80°C. Доставка образцов сыворотки осуществлена в замороженном виде насухом льду. В дальнейшем пробы хранили при температуре -80°C.Образцы мочи собирали до введения пептидов (пробы бланковой мочи) и винтервалах времени, соответующих 0-1, 1-2, 2-4, 4-6, 6-12 и 12-24 ч после приемапрепарата.

Образцы мочи аликвотировали и хранили при температуре -80°C.Доставка образцов осуществлена в замороженном виде на сухом льду. Вдальнейшем хранение проб осуществлялось при температуре -80°C.68Глава 3. Результаты и обсуждения3.1 Сравнение различных in vitro и in vivo моделей метаболизмасинтетических допинговых соединений пептидной природыВ данном разделе приведены результаты исследования эффективностиразличных моделей in vitro метаболизма синтетических допинговых соединенийGHRP: в присутствии протеолитических ферментов, человеческой плазмы крови,микросом почек и печени, а также S9 фракции печени человека.3.1.1 Протеолитические ферментыПротеолитическиеферментычастоиспользуютсядляизученияметаболизма различных соединений.

В рамках данного исследования ферментывыбирали на основе предположений о вероятности их вовлеченности в процессыдеградации изучаемых веществ, а также исходя из субстратной специфичности итканевой локализации. На основе литературных данных [154–156] выбраныследующиепротеолитическиеферменты:аминопептидаза N,карбоксипептидаза В и карбоксипептидаза М, полученные с использованиемразличных подходов: генно-инженерных и выделенных из биосырья (Таблица 7).Фермент карбоксипептидаза В (CPB, CPDB, так же известный какпротаминаза, панкреатическая карбоксипептидаза В, пептидил-L-лизин [Lаргинин] гидролаза, тканевая карбоксипептидаза В) представляет собой Zn 2+–зависимую специфическую панкреатическую экзопептидазу, участвующую впищеварении белков и пептидов. CPB высоко специфична по отношению к Сконцевым основным аминокислотным остаткам Lys или, предпочтительно, Arg,однако также может осуществлять гидролитический гидролиз пептидных связейперед аминокислотными остатками Val, Leu, Ile, Asn, Gly и Gln [157].Экзопептидаза CPB используется для установления первичной структурыпептидовибелковпутемпоследовательногоотщепленияС-концевыхаминокислот [5].

Одними из ингибиторов CPB являются хелатирующие агенты,связывающиенеобходимыедляферментативнойнапример, ЭДТА или 1,10-фенантролин.69активностиионыZn2+,Таблица 7 — Протеолитические ферменты, использованные для получения метаболитов GHRP [153–155]НазваниеКарбоксипептидаза ВКарбоксипептидаза MЛейцин-аминопептидаза(Leu-аминопептидаза)Аминопептидаза NКлассификационныйномерEC 3.4.17.2Отщепление C-концевогоаминокислотного остаткализина (Lys) илиаргинина (Arg)EC 3.4.17.12Отщепление C-концевогоаминокислотного остаткализина (Lys) илиаргинина (Arg)EC 3.4.11.2Расщепление пептиднойцепи по N-концевомуаминокислотномуостатку, наиболеепредпочтительно - поаланину (Ala)Аланин-аминопептидаза,Аминопептидаза NЭндопептидаза Lys CСпецифичностьЕС 3.4.21.50Расщепление пептиднойцепи поаминокислотномуостатку лизина (Lys)70КофакторИсточникиZn2+Поджелудочная железакрупного рогатого скота,свиней, некоторых видоврыб, в том числефибробласты кожи имозговое веществонадпочечниковZn2+Zn2+―Широко распространена вразличных тканях и клеткахМембранно-ассоциированнаяпептидаза, локализуется намембранах стенок тонкогокишечника, эпителиальныхклетках почек, мембранахмозга―Источники коммерческидоступных вариантовБычья, из поджелудочнойжелезыЧеловеческаярекомбинантнаяЧеловеческаярекомбинантнаяБычья почечнаямикросомальнаяЧеловеческаярекомбинантнаяLysobacter enzymogenesФермент карбоксипептидаза М (CPМ, так же известный, как почечнаякарбоксипептидаза или мочевая карбоксипетидаза B) представляет собой Zn2+зависимую экзопептидазу, специфически отщепляющую С-концевые остаткиосновных аминокислот белков и пептидов.

Он широко распространен в тканях иклетках организма человека, играет важную роль в регуляции биологическойактивности многих гормонов и факторов роста пептидной природы, участвует вдеградации экстрацеллюлярных белков и белок-белковых взаимодействиях наповерхностях клеток, системе узнавания комплемента, коагуляции/фибринолизе иадгезивных процессах[158]. CPМ являетсягликозилфосфатидилинозитольныйпринадлежащимкCPN/Eякорьмембранно-связанным черезпротеолитическимподсемействурегуляторныхферментом,металл-зависимыхкарбоксипептидаз. Растворимая форма карбоксипептидазы М обнаружена вомногих жидкостях организма в том числе и в моче, где она осуществляетгидролитическое расщепление эпидермального фактора роста (EGF, от англ.epidermal growth factor) с высвобождением пептида des-Arg53-EGF и свободногоаргинина [159].

Поскольку основным объектом исследования в антидопинговомконтроле является моча спортсменов, карбоксипептидаза М вызывает особыйинтерес с точки зрения оценки возможности ее влияния на метаболизмсоединений класса GHRP [5].Фермент аминопептидаза N (APN, так же известный, как мембраннаяаланин-аминопептидаза, амино-олигопептидаза, пептидаза Е, CD13, ANPEP)являетсяZn2+-зависимойэкзопротеазой,осуществляющейгидролитическоерасщепление по N-концевому аминокислотному остатку пептида, амида илиариламида X-|-Y-----, где X – Ala или другая аминокислота. Если за N-концевымгидрофобным аминокислотным остатком следует Pro, то происходит расщеплениеполипептидной цепи по второй пептидной связи с высвобождением дипептида XPro [160–162].

Аминопептидаза N, инактивирующая брадикинин, энкефалин идругие биоактивные пептиды, является рецептором короновирусов [163]. Такимобразом, она представляет собой очень перспективную in vitro модель дляполученияметаболитовGHRP,так71какисходныепептидыявляютсяпроизводными лей- и мет-энкефалинов, и часть из них имеет Ala на N-концеаминокислотной последовательности.Эндопептидаза Lys C (ЕС 3.4.21.50, так же известная, как лизилэндопептидаза, Achromobacter lyticus основная протеиназа I) представляет собойпротеолитический фермент класса S1 сериновых протеаз, выделенный измикроорганизма Lysobacter enzymogenes. Субстратная специфичность ферментазаключаетсявгидролитическомрасщепленииполипептиднойцепипокарбоксильной группе аминокислотного остатка Lys ---Р4-Р3-Р2-Р1-|-Р'1-Р'2-Р'3- свысвобождением пептидов ---Р3-Р2-Р2-Р1 и Р'1-Р'2-Р'3--, где Р1 – Lys.