Диссертация (Прогнозирование метаболитов рилизинг-пептидов гормона роста в организме человека для разработки методики их определения в целях антидопингового контроля), страница 11

Однако большинство пептидных препаратов, представляющих интерес успортсменов в качестве допинга, проходят доклинические или клиническиеиспытания и пока не одобрены FDA или иными органами государственногорегулирования в области здравоохранения для применения человеком в качестветерапевтическихсредств,чтоосложняетизучениеметаболизмаin vivo.Альтернативным вариантами изучения метаболизма подобных соединенийявляются методы in vivo с участием в экспериментах различных видов животныхи in vitro, не требующими участия человека и одобрения Этическим комитетом.В настоящее время информация о метаболизме соединений класса GHRPограничена данными, полученными с использованием моделей in vitro или in vivoв экспериментах на крысах и лошадях.

Метаболизм GHRP у крыс и лошадейможет значительно отличаться от их метаболизма в человеческом организме.Поэтому при разработке эффективного метода определения метаболитов GHRPнеобходимоопределитьоптимальнуюмодельin vitroсиспользованиемсубклеточных фракций человека для моделирования основных направлений ихбиотрансформации.гипотетическоеЭффективнаячислоin vitroвозможныхмодельметаболитов,позволитсократитьидентифицируемыхвэкспериментах in vivo. Изучение метаболизма GHRP in vivo в человеческоморганизме поможет выявить наиболее интенсивные и долгоживущие метаболиты.Разработка методики определения GHRP их метаболитов позволит увеличитьэффективностьантидопинговойпрограммыдлязлоупотребления данного вида допинга спорстменами.55выявленияфактовГлава 2.

Экспериментальная часть2.1 Химические реактивы и материалыCертифицированные стандартные материалы: GHRP-1 и его метаболитовGHRP-1 (2-7) ОН,GHRP-1 (3-7) ОН,GHRP-1 (3-6) ОН,GHRP-1 (2-7) NH2иGHRP-1 (3-7) NH2; GHRP-2 и его метаболита GHRP-2 (1-3) ОН; GHRP-4; GHRP-5;GHRP-6; алексаморелина; гексарелина и его метаболитов гексарелин (1-6) ОН,гексарелин (1-3) ОН; ипаморелина и его метаболитов ипаморелин (1-5) ОН иипаморелин (1-4) ОН синтезированы фирмой Thermo Fisher Scientific GmbH,Германия. Метаболиты GHRP-6 (1-6) ОН, GHRP-6 (2-6) NH2, GHRP-6 (2-6) ОН иGHRP-6 (2-5) ОН, гексарелин (1-3) ОН и гексарелин (2-5) ОН предоставленыКатрин Гебель (Australian Sports Drug Testing Laboratory, Сидней). В качествевнутренних стандартов использовали изотопно меченые аналоги GHRP2 ([13C3;15N1]Ala3-GHRP-2, ВС1) и GHRP-2 (1-3) (Ala-(D-β-Nal)-([13C3;15N1]AlaNH2, ВС2)), синтезированные фирмой Thermo Fisher Scientific GmbH, Германия.Для экспериментов in vitro применяли человеческие рекомбинантныечеловеческие протеолитические ферменты: аминопептидазу N (rhAPN, ЕС3.4.11.2), карбоксипептидазу М (rhCPM, EC 3.4.17.1), предоставленные фирмойR&D Systems, США, карбоксипептидазу В (rhCPB, EC 3.4.17.2)–Sino BiologicalReagents, Китай; бычью почечную микросомальную лейциновую аминопептидазу(Leu-AP, ЕС 3.4.11.2), карбоксипептидазу В (CPB, EC 3.4.17.2) из бычьейподжелудочной железы, приобретенные у фирмы Sigma-Aldrich, США, иэндопептидазу (Lys C, ЕС 3.4.21.50)–Promega, США.

В работе использовалисубклеточные фракции: микросомальную фракцию почек человека, Celsis, США;микросомальнуюфракциюпеченииS9фракциюпеченичеловека,BD Biosciences, США. Дезамидирование исследуемых пептидов проводили сприменениемрекомбинантнойамидазы,составНАДФH-регенирирующегораствора включал дрожжевую глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу фирмы SigmaAldrich, США.В работе использовали хлорид магния, хлорид кальция, хлорид натрия, 2-(Nморфолино)этансульфоновуюкислоту56(MES),этилендиаминтетрауксуснуюкислоту (ЭДТА), натриевую соль D-глюкозо-6-фосфата фирмы Sigma-Aldrich(США); фосфатно-солевой буфер (ФСБ) – Amresco, Канада; карбонат аммония –AppliChem, Германия; трис(гидроксиметил)аминометан (Tris) – GE Healthcare,Бельгия; никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФH) марки химическойстепени чистоты – Santa Crus, США; натрий фосфорно-кислый одно- и двузамещенный марки ч.д.а.

и х.ч., соответственно, – Химмед, Россия.В работе использовали воду фирмы Biosolve, Франция; ацетонитрил – Baker,Германия; метанол – Merck, Германия; муравьиную и трифторуксусную кислоты –Fluka, Швейцария; уксусную кислоту – Panreac, Германия. Все используемые дляВЭЖХ реактивы были хроматографической степени чистоты. Для калибровкимасс-спектрометров использовали смесь для калибровки Pirce LTQ Velos ESI IonCalbration Solution и раствор 1,3,6-политирозина фирмы Thermo Scientific,Германия, рекомендованные производителем; для проверки работоспособностисистем наноВЭЖХ-МСВР и СВЭЖХ-МС/МС – 1.6 нМ раствор цитохрома С(Cytochrome C digest) фирмы Thermo Scientific, США, и Met-Arg-Phe-Ala (MRFA)– Research Plus Inc., США.2.2 Основное оборудованиеАнализ методом СВЭЖХ-МС/МС проводили на жидкостном хроматографеUltimate 3000 LS, соединенным с тройным квадрупольным масс-анализаторомTSQ Quantiva фирмы Thermo Scientific, США, оснащенным внешним источникомнагреваемой электрораспылительной ионизации при атмосферном давлении.АнализметодомнаноВЭЖХ-МСВРпроводилинананопотоковомхроматографе Dionex Ultimate 3000 LS Nano и масс-спектрометре высокогоразрешения гибридного типа Q Exactive, оснащенном внешним источникомэлектрораспылительной ионизации при атмосферном давлении, фирмы ThermoScientific, Германия.ТФЭ осуществляли при помощи вакуумного манифолда фирмы Restek,США, подключенного к вакуумному насосу фирмы Millipore, США, сиспользованием картриджей Oasis®WCX (30 мг, 1 мл) и Oasis®HLB (60 мг, 3 мл)57фирмы Waters Inc., США.

ТФЭ с использованием 96-луночных планшетов длямикроэкстракции Oasis®WCX (2 мг) проводили с помощью концентрирующейстанции Positive Pressure-96 фирмы Waters Inc., США, подключенной к генераторуазота фирмы Peak Scientific, Великобритания.2.3 Вспомогательное оборудованиеВ работе использовали настольную центрифугу модели MiniSpin Plusфирмы Eppendorf, США, напольную центрифугу модели Rotixa 50RS фирмыHettich, Германия, термошейкер модели Thermomixer Comfort фирмы Eppendorf,США, вихревой встряхиватель модели Fisher Vortex Genie2 фирмы FisherScientific, Германия, вакуумный центрифужный упариватель модели miVacфирмы Genevac, Великобритания, аналитические весы модели Discovery фирмыOHAUS, Швейцария, рН-метр модели Seven Compact фирмы Mettler-Toledo,Швейцария, ультразвуковую ванну модели Sonorex Digitec фирмы Bandelin,Германия, дозаторы переменного объема (1–10, 20–200, 100–1000, 500–5000 и1000–10000 мкл), механические степперы модели Multipette plus с электроннымдисплеем фирмы Eppendorf, Германия.2.4 Методика эксперимента2.4.1 наноВЭЖХ-МСВР анализ GHRP и их метаболитовДля хроматографического разделения компонентов образца применялианалитическую колонку Zorbax 300 SB-C18 (75 мкм × 150 мм, размер частиц3.5 мкм)фирмыAgilent,США,ипредколонкудляконцентрированияAcclaim Pep Map 100 (75 мкм × 2 см, размер частиц сорбента 3 мкм) фирмыThermo Finnigan, Германия.

В качестве элюента загрузочного насоса длянанесения образца на концентрирующую предколонку использовали загрузочныйбуферныйрастворвода/ацетонитрил/муравьинаякислота/трифторуксуснаякислота 98/2/0.1/0.08 (об./об./об./об.). Элюирование на концентрирующуюколонку проводили по программе: 0–5 мин – 100 % загрузочным буфернымраствором, скорость потока составляла 3 мкл/мин. В качестве подвижных фазприменяли0.1% раствормуравьиной58кислотывводе(А)исмесиацетонитрил/вода 80/20 (об./об.) (В), соответственно. Разделение компонентовсмеси проводили градиентным элюированием по следующей программе: 0 мин –5% (В); 5 мин – 5% (В); 25 мин – 95% (В); 30 мин – 95% (В); 31 мин – 5% (В);38 мин – 5% (В), скорость потока 350 нл/мин.

Объем образца – 1 мкл.Температура термостата колонок – 25°С, общее время анализа – 38 мин.Детектирование исходных пептидов и их метаболитов проводили в режимерегистрации положительных ионов с использованием наноспрея со стальнымэммитером фирмы Thermo, Германия. Параметры масс-спектрометра: напряжениена эмиттере – 2.1 кВ; температура внутреннего капилляра – 275°С; максимальноевремя накопления ионов – 100 мс; окно изоляции ионов – 2.0 а.е.м.; скоростьсканирования – 1 скан/сек. Анализ проб проводили в двух режимах сканирования:по полному ионному току (Full MS) с разрешением 70 000 в диапазоне массm/z 50-1100 и SIM с окном изоляции 2 Да, разрешением 35 000 и последующейфрагментациейионов-прекурсоровсоединений(tSIM-tMSMS).Энергиясоударения – 25 эВ, точностью определения масс – 5 млн-1. Масс-спектрометркалибровали с использованием смеси для калибровки Pirce LTQ Velos ESI IonCalbration Solution, для проверки работоспособности наноВЭЖХ-МСВР системыанализировали раствор после трипсинолиза цитохрома С перед каждой сериейанализа.Полученные данные обрабатывали с использованием программногообеспечения Xcalibur версия 2.2.

Точные массы одно- и двухзарядных ионовпрекурсоров исходных соединений и их метаболитов, а также точные массы ихфрагментных ионов рассчитывали с помощью программы Mass Prospector(http://prospector.ucsf.edu/). Во избежание ложноположительных результатовдополнительнымикритериямисоответствиявыбраныследующие:длинагипотетического определяемого метаболита исходного пептида должна быть неменее трех аминокислотных остатков, один из которых должен представлятьсобойискусственнуюаминокислотуилихимическуюотличающую соединение от веществ эндогенного происхождения.59модификацию,2.4.2 СВЭЖХ-МС/МС анализ GHRP и их метаболитовДляхроматографическогоразделениякомпонентовиспользовалианалитическую колонку Zorbax 300 SB-C18 (1 × 50 мм, размер частиц сорбента3.5 мкм), соединенной с предколонкой Stable Bond Guard (1 × 17 мм, размерчастиц сорбента 5 мкм) фирмы Agilent, США.