Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа, страница 9

После восстановления ЧСА дититриитол удаляли диализом противфосфатно-солевого буфера.40Для получения гликированного ЧСА оба препарата (40 мг/мл) инкубировали с глюкозой(0, 5 и 50 мМ) в фосфатно-солевом буфере (1.47 мМ KH2PO4, 5.2 мМ Na2HPO4, 145 мМ NaCl,2.7 мМ KCl, азид натрия 0,05%; рН 7.4) при 37 ºС. Аликвоты для отбирали после 1 и 3-х недельинкубации, предварительно каждую порцию диализовали против фосфатно-солевого буфера втечение 12 часов, три раза меняя буфер, чтобы удалить несвязавшуюся глюкозу. Доисследования образцы хранили при -70 ºС.Гликирование в нефизиологических условияхДля получения гликированного ЧСА белок (20 мг/мл) инкубировали с глюкозой 1,6 М ив отсутствие глюкозы в фосфатно-солевом буфере при 37 ºС в течение 3-х недель.ЧСА окисляли перманганатом калия (1 мМ, 72 ч.) при комнатной температуре.Определение количества белка, кетоамина, SH-групп и карбонильных групп.

Кетоаминопределяли с помощью колориметрического метода с применением ТНС по методу [136],количество SН-групп – по методу [187] с помощью реактива Эллмана (5,5’-дитиобис-(2нитробензойной кислота)). Карбонильные производные определяли по методу [188] с помощью2,4-динитрофенилгидразина. Количество белка определяли методом Бредфорда [189] и пооптической плотности при λ=280 нм. Коэффициент экстинции использовали ζ=34445 М -1см-1.Оптическую плотность измеряли на планшетном ридере (Anthos 2010, Австрия) и наспектрофотометре «Carry» (США).Спектр флуоресценции ЧСА и его гликированных форм определяли на флуориметре(Varian Cary Eclipse, США) при λвозбуждения =285, λиспускания =290-500 нм; концентрация белка вовсех образцах была одинакова - 2 мг/мл. Флуоресценцию пентозидина измеряли приλвозбуждения=325; λиспускания =330-550 нм; концентрация белка составила 4 мг/мл.

Образцынаходились в фосфатно-солевом буфере, pH 7,4.Разделение ЧСА с помощью ВЭЖХ. Ионообменную хроматографию альбуминапроводили на хроматографе Varian (США) c анионообменной колонкой Mini Q 4.6/50 PE (GEHealthcare Швейцария) размером 4,6x50 мм. Размер частиц носителя полистерол/дивинилбензол 3 мкм. В качестве подвижной фазы А использовали буфер, содержащий 0,04 Мфосфорной кислоты и 0,04 М уксусной кислоты в соотношении 1:1. До pH 6,4 доводили 25%аммиаком. Подвижная фаза В содержала этот буфер и 1 М NaCl.

Градиент 1 М NaCl по буферуА: 1 мин. – 100%, 2 мин. – 99,5%, 3 мин. – 99,5%, 4 мин. – 95%, 6 мин – 95%, 6,5 мин. – 90 %, 8мин. – 90%, 8,5 мин. – 80%, 9,5 мин. – 80%, 11 мин. – 50%, 11,5 мин. – 50%, 12,5 мин. – 0%, 14мин. – 0%. Скорость потока 1,5 мл/мин. Белок регистрировали по флуоресценции при λвозбуждения= 285 нм и λиспускания = 340 нм и по поглощению при λ = 280 нм.Электрофоретическое разделение сывороточных белков в агарозе проводили спомощью диагностического кита (Cormay gel protein 100, Польша) в течение 15 минут при 100V.41Выделение альбумина из сыворотки крови с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ)проводили согласно методике Mashiba S.

[136]. Для подбора оптимального соотношениясыворотки и ПЭГ смешивали 150 мкл сыворотки здорового донора и 15, 30 и 60 мг ПЭГ6000(Sigma, США); затем центрифугировали при 2000 x g 15 минут на центрифуге (Hermle,Германия). Надосадочную жидкость анализировали методом электрофореза в агарозном геле.Выделение альбумина из сыворотки крови с помощью ТХУ/спиртаМетод выделения альбумина, описанный в статье Debro J.R. [190], основан на том, чторастворимость альбумина практически во всех растворителях выше растворимости белковсыворотки.

В связи с этим выделение альбумина проводят в условиях, когда прочие белкисыворотки образуют нерастворимый осадок, а альбумин остаётся в растворе. В статьепредлагается выделять альбумин из 3 мл сыворотки крыс. Мы адаптировали эту методику подте объёмы сыворотки крови детей, которыми располагаем.К 150 мкл сыворотки при постоянном помешивании добавляли по капле 450 мкл 1,5%трихлоруксусной кислоты (ТХУ) (Sigma, США) в 96% этаноле. Суспензию покачивали 30 минпри комнатной температуре и затем центрифугировали при 10 тыс.

об./мин. при 4 ºС.Супернатант отделяли от осадка и к 400 мкл добавляли 400 мкл подвижной фазы А (см. выше) и40 мкл 25% NH4OH для нейтрализации ТХУ. Затем выпаривали спирт на роторном испарителе(Eppendorf, Германия) до первоначального объёма 400 мкл (таким образом, заменяли спирт наподвижную фазу А и подготавливали образец для нанесения на ионообменную колонку)Выделение альбумина из сыворотки крови с помощью голубого геляДля выделения ЧСА из сыворотки с помощью аффинной хроматографии на голубомгеле (Affi gel blue, Bio Rad, США) использовали методику, предложенную производителями, снашей модификацией.

Перед нанесением образца 2 мл геля уравновешивали 4 мл 20 мМфосфатного буфера (pH 7,2), сыворотку разбавляли в 2 раза тем же буфером и пропускали черезгель 500 мкл, затем все белки, кроме альбумина, элюировали тем же буфером, содержавшим 0,2и 0,4 М NaCl (по 2 мл каждый). Альбумин смывали 4 мл 20 мМ фосфатным буфером с 1,5 МNaCl. Далее образец диализовали, концентрировали с помощью ультрацентрифужных фильтровAmicon-Ultra 30 kDa (Merck Millipore, Германия) и определяли следующие показатели:количество белка, содержание кетоамина, содержание SH-групп в молекуле альбумина.Определение сайтов связывания в гликированном альбуминеВ работе использовали 2,5- дигидроксибензойную кислоту (Bruker Daltonics, Германия),бикарбонат аммония (NH4HCO3), ТФУ, муравьиную кислоту, соли и другие реактивы (SigmaAldrich, США), свиной модифицированный трипсин (Promega, США).Сайты гликирования определяли в образцах восстановленного и окисленного42альбумина, инкубированных в присутствие 50 мМ глюкозы 3 недели при 37 ºС.

Для данногоисследования образцы альбумина подвергали гидролизу трипсином. К 5 мкл каждого образцадобавляли 50 мкл 50 мМ бикарбонатного буфера, содержавшего 20 мкг/мл трипсина. Времяреакции составляло от 15 мин до 24 часов. Реакции останавливали добавлением к реакционнымсмесям 20 мкл 7% (об./об.) ТФУ.Длярегистрациимасс-спектровMALDI-TOF(времяпролетнаяматрично-активированная лазерная десорбция/ионизация) в качестве матрицы использовали DHB, 10мг/мл в 50% ацетонитриле и 0,3% ТФУ.

0,5 мкл полученных продуктов гидролиза смешивали с0,5 мкл раствора матрицы, высушивали на воздухе и помещали в масс-спектрометр длярегистрации спектров. Масс-спектры регистрировали на масс-спектрометре MALDI-TOF BrukerUltraflex TOF/TOF II (Bruker Daltonics, ФРГ), оснащенном Nd:YAG- лазером (λ=337 нм),оборудованном системой задержки экстракции ионов Bruker PAN и аппаратурой длярегистрации тандемных масс-спектров LIFT. Масс-спектры регистрировали в диапазоне m/z от500 до 2000 с измерением положительных ионов в рефлекторном режиме с ускоряющимнапряжением 25 кВ.

Каждый спектр получали суммированием 500–1500 единичных спектров,регистрируемых после одного лазерного импульса. Пики автолиза трипсина и теоретическирассчитанные молекулярные массы пептидов альбумина использовали для внутреннейкалибровки полученных спектров, что обеспечило точность определения масс не хуже 20 мд.Для обработки и анализа полученных спектров использовали пакет программ BrukerFlexAnalysis (Bruker Daltonics, ФРГ).Анализ аминокислотных последовательностей белков и расчет теоретических масспептидов, образованных при гидролизе исходных белков трипсином, теоретических масспептидов с возможными модификациями, обусловленными гликированием, а также масс b- и yфрагментов отдельных пептидов проводили при помощи программы GPMAW (Lighthouse data,Дания).

Идентификацию белков по массам пептидов - продуктов гидролиза трипсином - и поспектрам фрагментации отдельных пептидов проводили при помощи системы идентификациибелков Mascot (MatrixSciense, Великобритания) и по базе данных NCBInr Национального центрабиотехнологической информации США (NCBI). При поиске в базе данных в качествеспецифической протеазы указывали трипсин и возможность неполного гидролиза (до трехосновных остатков в пептидах). Конфигурация сервера Mascot была изменена и дополненаизвестными вариантами КПГ, модифицирующими лизин и аргинин (рис. 11).

При работе сбазой данных учитывалось до 7 модификаций, что вызвано ограничениями системы Mascot изза вероятности получения ложноположительных результатов.Кроме того, продукты гидролиза трипсином гликированных in vitro образцовсывороточного альбумина человека и контрольный образец анализировали с использованием43системы ВЭЖХ, совмещенной с масс-спектрометром типа орбитальной ионной ловушки QExecutiv (Thermo, США). Разделение смеси осуществляли с помощью ВЭЖХ хроматографаUltimate 3000 nano-flow HPLC (Dionex США) на колонке Acclaim PepMap RSLC nanoViper 75мкм х150 мм С18, 2 мкм, 100 Å (Thermo, США).

На колонку наносили 1 мкл реакционнойсмеси. Разделение проводили в линейном градиенте буфера В 5-60% за 60 минут при скоростипотока 0,3 мкл/мин, температуре колонки 40 ºС. В качестве подвижной фазы использовали 1%раствор муравьиной кислоты в воде (буфер А), и 1% муравьиной кислоты в 80% ацетонитриле(буфер В). Выход колонки был совмещен с ионным источником - наноэлектроспреем, так чтомасс-спектрометр использовался в качестве детектора хроматографа.

Спектры были получены врежиме положительных ионов, с разрешением 60000 (m/z 400) для MS и 15000 для MS/MS.Анализ проводился в режиме анализа данных в реальном времени: после обзорногосканирования для 5 наиболее интенсивных ионов регистрировали спектры фрагментации,достигаемой диссоциацией при высоких энергиях столкновений, HE CID (энергия 35 эВ) [191,192]. После регистрации спектров фрагментации родительские ионы на 60 сек исключались изанализа. Спектры фрагментации однозарядных родительских ионов не регистрировали.Таким образом, были измерены массы пептидов и получены спектры фрагментации сболее высоким разрешением и точностью измерения молекулярных масс фрагментов,полученных в результате гидролиза пептидов.