Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа, страница 7

Было показано, что КПГ накапливаются вцитоскелете и миелиновых оболочках нервных волокон пациентов с продолжительнымдиабетом [119].Один из КПГ – пентозидин – представляет собой перекрестную сшивку междуаргинином, лизином и пентозой (рис. 12).29Рисунок 12. Cтруктура пентозидина [120].Исследование флуоресценции и сшивок в коллагене диабетических больных показалоприсутствие имидазо[4,5-b] пиридиновой структуры.

Пятиуглеродные сахара, способствующиеформированию пентозидина, могут быть сформированы из более крупных сахаров путемокислительной фрагментации или от триоз, тетроз и кетоз путем конденсации и обратимойальдольной реакции. В крови пентозидин связывается с белкам плазмы, в хрусталике глаза – сводорастворимыми и нерастворимыми белковыми фракциями и особенно увеличивается прикатаракте [121]. На аутопсийном материале показано, что пентозидин экспоненциальнонакапливается в коже и значительно повышается при уремии [122]. Пентозидин относительнопросто определить количественно и он часто используется для измерения общего количестваКПГ в экспериментальных исследованиях.3.3. Гликирование белков плазмы кровиАльбумин составляет 50% от всех белков плазмы, а его гликирование занимает 80% отвсех гликированных белков в кровотоке [110].

Однако остальные белки также подверженынеферментативному гликированию и могут вносить значительный вклад в общее количествокетоамина в крови. Большинство белков плазмы имеют период полужизни тот же, что иальбумин — 1-2 недели [123].3.3.1. ФибриногенФибриноген необходим для свёртывания крови и превращается в нерастворимыйфибрин, составляющий 4%. Фибриноген – белок, состоящий из трех пар неидентичных цепей,соединенных между собой дисульфидными связями и имеющий молекулярную массу около34,0000 дальтон. Этот белок вносит небольшой вклад в ферментативное присоединениеуглеводов и имеет период полураспада 3~4 дня.

Было показало, что концентрация фибриногена,его упаковка и время свёртывания (формирование сгустка) не отличаются у лиц с диабетом издоровых [124].Тем не менее, встречаются сообщения о нарушении фибринолиза вследствиегликирования фибрина [125]. Сообщалось, что фибриноген может содержать КПГ, что можетпривести к сосудистым нарушениям и атеросклерозу больных сахарным диабетом [126].303.3.2. КоллагенКоллаген, основной компонент внеклеточного матрикса, является доступной мишеньюдля неферментативного гликирования [127, 128]. Этот наиболее долгоживущий и самыйбольшой белок у млекопитающих расположен во внеклеточном матриксе в виде нерастворимыхволокон, которые составляют большую часть кожи, сухожилий, кровеносных сосудов, костей,зубов, роговицы и стекловидного тела. Коллаген также обеспечивает основу для большинствапаренхиматозных органов.

Так как коллаген сохраняется в организме в течение многих лет(например, период полужизни коллагена в коже составляет 15 лет) и постоянно экспонировандля воздействия глюкозы, как в сосудах, так и во внесосудистых жидкостях, он накапливаетконечные продукты гликирования, в том числе пентозидин [129]. Это приводит к изменениюсвойств коллагена, например, происходит уменьшение гибкости молекулы и увеличениежесткости, что способствует повышенной хрупкости костей [130].3.3.3.

Ig GИммуноглобулины составляют около 20% от всех белков крови. Основную часть всехиммунноглобулинов крови составляет IgG (70-75%). IgG имеет четыре N-концевыхаминокислоты и 80 остатков лизина, благодаря чему он является прекрасной мишенью дляприсоединения глюкозы [131]. Гликирование IgG оказывает влияние на его функциональнуюактивность и вызывает структурные нарушения [111, 132, 133]. Любые изменения в Fc- илиFab-фрагментах иммуноглобулина могут привести к потере его активности [134].

ГликированиеIgG ассоциировано с воспалением; продукты гликирования являются мишенью для аутоантителубольныхревматоиднымартритом,такжеихобразованиеприводиткиммуносупрессии у диабетиков [111].Важными факторами в гликировании белка является его количественное содержание ипериод полужизни. IgG с периодом полураспада 24 дня занимает значительную долюгликирования всех белков [135]. При инкубации IgG c глюкозой in vitro была показана егоспособность присоединять значительное количество остатков глюкозы [132].К сожалению, в литературе крайне мало данных о вкладе белков плазмы в «общий»кетоамин. Встречаются единичные сообщения о содержании кетоамина в плазме и в альбумине.Так, в работе Fu M.

[136] было показано, что при отделении альбумина от сывороточныхглобулинов с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) отношение кетоамина в альбумине ккетоамину в плазме составило 1:1,3.313.4. Методы определения гликированного альбуминаВ последние годы к гликированному альбумину проявляется большой интерес как кальтернативному показателю гликемического контроля. Как уже отмечалось, стандартнымиклиническими методами являются определение содержания глюкозы и гликированногогемоглобина.

Содержание глюкозы дает информацию только на данный конкретный моментвремени. Гликированный гемоглобин (HbAlc) – общепринятый маркер, сообщающий огликемическом статусе за довольно длительный период – 3-4 месяца, что обусловленопродолжительностью жизни гемоглобина в крови, равное 90-120 дней [106, 137].

Этот маркернельзя использовать при анемии, переливании крови или если требуется оценитьэффективность назначенного инсулина в период нахождения пациента в стационаре. Для этойцели подходит альбумин, т.к. период его полужизни составляет 12-21 день [138] или до 27 дней[84]. Гликированный альбумин предоставляет информацию о гликемическом статусе до того,как изменится HbAlc (рис. 13). Стоит, однако, принимать во внимание, что скоростьметаболизма альбумина может измениться при некоторых заболеваниях, например, скоростьсинтеза уменьшается при заболеваниях печени, потеря альбумина увеличивается принефротическом синдроме.Рисунок 13.

Различные маркеры гликемического контроля отражают гликемический статус вразличном отрезке времени.Оценка уровня общего кетоамина в крови применяется в клинических лабораториях какмаркер гликирования белков. Основной вклад в общий кетоамин вносит альбумин благодарясвоей высокой концентрации [138, 139]. Как было отмечено выше, в сыворотке другие белкитакже гликируются. Однако неизвестно, насколько существенен их вклад в общее содержаниекетоамина по сравнению с альбумином в связи с отсутствием систематических исследований.Для измерения гликированных белков в плазме часто применяются колориметрическиеметоды — с тетразолием нитросиним (ТНС), тиобарбитуровой кислотой, гидразином.Метод с применением ТНС широко распространен в клинических лабораториях и32используется для количественного измерения кетоамина в крови — т.

е. суммарнойконцентрации всех гликированных белков. Реакция с ТНС основана на способности Nсвязанного кетоамина восстанавливать краситель в щелочном растворе до цветного продукта —формазана, поглощающего на 570 нм [140, 141] (рис. 14). В качестве калибратора вкоммерческих наборах используется олиго- или полилизин с присоединенным к немуизвестным количеством кетоамина.Рисунок 14.

А - тетразолий нитросиний; Б - превращение ТНС в формазан.Колориметрической метод с тиобарбитуровой кислотой не является специфическим итакже позволяет определить суммарный кетоамин в сыворотке крови. При реакции сфенилгидразином получается аддукт фенилгидразон с максимумом поглощения на 350 нм. Этотметод разрабатывался в 80-х годах, но дальнейшего применения не получил. David A. иKobayashi K. измеряли кетоамин в белках с помощью метода, основанного на колориметрии 2кето-глюкозы, которая высвобождается из гликированного белка при нагревании с гидразином[142, 143].Таким образом, реакции, основанные на образовании цветных продуктов, не являютсяспецифическими для альбумина и количественно измеряют «общий» белковый кетоамин, т.

е.количество молекул глюкозы, неферментативно соединенных с аминогруппой. Поэтому дляопределения кетоамина в альбумине необхолима дополнительная стадия выделения альбуминаиз сыворотки крови.33Концентрация гликированного альбумина может быть измерена несколькими методами.Так, часто применяется боронат-аффинная хроматография [144-146], где в качестве лиганда длясвязывания гликированного альбумина используется аминофенилбороновая кислота.

Методоснован на взаимодействии двух гидроксильных групп кислоты с двумя гидроксильнымигруппами остатка глюкозы в белке, что позволяет отделить гликированный альбумин отнегликированного. В дальнейшем способ идентификации продуктов реакции может отличаться:количественногликированныйальбуминможетдетектироватьсяспомощьюмасс-спектрометрии [147] или анионобменной ВЭЖХ [146]. Бороновая кислота также может бытьсорбирована на твердую фазу и использована для иммуно-ферментного анализа (такназываемый ELBIA, enzyme-linked boronate-immunoassay) [148]. Пример использованиябороновой кислоты изображен на рисунке 15.Рисунок 15.

Использование фенилбороновой кислоты для удерживания гликированного ЧСА. Всвязывании активное участие принимает тетрагидроборонатный анион, формируемый в щелочныхусловиях [84].В методе ИФА также применяются специфические моноклональные антитела,распознающие неферментативно гликированные эпитопы в альбумине [149]. В настоящее времявыпускаются коммерческие ИФА-наборы для определения степени гликирования альбумина.Возможно также использование ферментативных методов с применением альбуминспецифической протеиназы для расщепления ЧСА с последующим окислением аминокислот,модифицированных глюкозой, кетоамиооксидазой и измерением выделившейся перекисиводорода (поглощение измерено при 555 нм) [130, 150].В качестве альтернативных методов были предложены рамановская спектроскопия, нетребующая дополнительных реагентов [151], капиллярный электрофорез [152] и другие34электрофоретические методы [153, 154].Различные состояния, связанные с такими нарушениями метаболизма альбумина, какпротеинурия, цирроз печени или гипотиреоз, могут влиять на измерение гликирования [155].Кроме того, было замечено, что увеличение количества гликированного альбумина встречаетсяпри некоторых васкулярных осложнениях, например, атеросклерозе, и может быть связано соксидативным стрессом или нарушением регуляции холестерина [156].3.5.

Исследование гликированного альбуминаВ литературе представлено множество работ по изучению гликирования альбумина invitro. Этот препарат несложно получить в лабораторных условиях, достаточно проинкубироватьбелок с глюкозой.Для изучения изменения структуры альбумина при гликировании и окисленииисследовали спектры флуоресценции [108, 157, 158], кругового дихроизма [158-161] и ЯМР[162]. Применяли иммунологические методы [163], электрофоретические [108, 164], ВЭЖХ[165-167]. Исследования сайтов связывания глюкозы с аминокислотами проводили в основном спомощью MALDI-TOF-MS [168-170]. В результате определяли какобщийуровеньгликирования, так и различные виды КПГ.