Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯМОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ТОНКИХХИМИЧЕСКИХ ТЕХНОЛОГИЙ ИМЕНИ М.В.ЛОМОНОСОВААВТОНОМНАЯ НЕКОММЕРЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ «ИНСТИТУТБИОМЕДИЦИНСКИХ ПРОБЛЕМ»На правах рукописиЛотош Наталья ЮрьевнаМаркеры, характеризующие гликемический статус и развитиенейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-готипаСпециальность 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)Диссертацияна соискание учёной степеникандидата химических наукНаучный руководитель:д.х.н. Селищева А.А.Москва 20152ОглавлениеСокращения и термины………………………………………………………………………………..4I.

ВВЕДЕНИЕ…………………………………………………………………………………………..5II. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР…………………………………………………….……………………91. Введение …………………………………………………………………………………………….92. Сахарный диабет 1-го типа: причины возникновения и иммунологические аспектыразвития…………………………………………………..……………………………………………102.1. Экспериментальные модели для исследования СД1………………………………...…112.1.1. Токсический диабет………………………………………………………….…112.1.2. Спонтанный диабет……………………………………………………….……122.2. Стадии развития диабета 1-го типа ……………………………………………….……122.2.1. Инсулиты ………………………………………………………………………142.2.2. Медиаторы воспаления ……………………………………………………..…152.2.3.

Аутоантитела при диабете 1-го типа..…………………………………...……172.3. Диагностика сахарного диабета 1-го типа……………………………………...………182.4. Дистальная полинейропатия ……………………………………………………………192.5. Нейрональные антитела при СД1 …………………………………………………..…213. Структура и функции человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) ………………………223.1. Окислительно-восстановительное состояние альбумина ………………………..……233.2. Гликирование альбумина…………………………………………………….…………..253.2.1. Ранние продукты гликирования …………..…………………...……………...263.2.2.

Конечные продукты гликирования………………………………….…………273.3. Гликирование белков плазмы крови……………………………………….……………293.3.1. Фибриноген ……………………………………………………………………293.3.2. Коллаген…………………………………………………………………………303.3.3. Ig G………………………………………………………………………………303.4. Методы определения гликированного альбумина……………………………...........…313.5. Исследование гликированного альбумина………………………………………...…....343.5.1.

Влияние гликирования и окисления на структуру и свойстваальбумина……………………………………………………………………………………….343.5.2. Исследование сайтов связывания с глюкозой……………………..………….37III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ……………………………………………………………...391. Исследование альбумина in vitro и в сыворотке крови…………………………………………..392.

Формирование групп пациентов с диагнозом СД1………………………………………………433. Определение проинсулина в сыворотке крови детей с СД1…………………………………….454. Электромиографическое исследование (ЭМГ)…………………………………………...………455. Определение аутоантител к нейрональным белкам в сыворотке детей с СД1…………………466. Экспериментальная модель диабета (СТЗ-крысы)……………………………………………....467. Статистическая обработка данных………………………………………………………………..473IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ………………………………………………………….…….471. Содержание проинсулина у детей с диабетом 1- го типа………………………………...…….472. Исследование гликированного альбумина in vitro ………………………………..........………512.1.

Окислительное гликирование альбумина in vitro…………………………………..….522.1.1. Определение содержания кетоамина, SH-групп и карбонильных групп вмолекуле альбумина, инкубированного в присутствии физиологических концентрацийглюкозы…………………………………………………………………………………….…..522.1.2. Определение сайтов гликирования в альбумине, предварительногидролизированном трипсином, методами MALDI –TOF и HPLC/MS/MS………..……..542.1.3. Флуоресценция ЧСА и содержащегося в нём пентозидина ……….………582.1.4.

Анионообменная ВЭЖХ различных препаратов альбумина………………612.2. Гликирование ЧСА в нефизиологических условиях………………………………..….643. Определение гликированного альбумина в сыворотке крови……………………………….….683.1. Подбор методик для выделения альбумина из сыворотки……………………...……..683.2 Определение гликированного альбумина у детей с диабетом 1-го типа………………744.

Выявление дистальной полинейропатии у детей с диабетом 1-го типа………………………..805. Определение аутоантител к нейрональным белкам у детей с диабетом 1-го типа…………...876. Определение нейрональных аутоантител у крыс с диабетом, вызваннымстрептозотоцином………………………………………………………………………………....90V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ……………………………………………………………….……………………94VI. ВЫВОДЫ………………………………………………………………………………………….96Список опубликованных научных работ по теме диссертации……………………………………97БЛАГОДАРНОСТИ……………………………………………………………………………..........98ЛИТЕРАТУРА…………………………………………………………………………………..……..994СокращенияELIBA – enzymelinked boronate immunoassayаАТ – аутоантителаGAD – glutamic acid decarboxylaseАПК – антигенпрезентирующие клетки(декарбоксилаза глутаминовой кислоты)ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостнаяHbAlc – гликированный гемоглобинхроматографияHMA – human mercaptalbumin (человеческийГФКБ – глиальный фибриллярный кислыймеркаптоальбумин)белокHNA1 – human nonmercaptalbumin1ДНФГ – 2,4-динитрофенилгидразин(человеческий немеркаптоальбумин 1)ДПН – дистальная полинейропатияIAA – insulin autoantibodies (аутоантитела кДТТИ – дитиотриитолинсулину)ИЛ – интерлейкинIA-2 – аутоантитела к тирозинфосфатазеИНФ-γ – интерферонICA – islet cell antibodies (аутоантитела кИФА – иммуноферментный анализостровковым клеткам)КПГ– конечные продукты гликированияLC/MS - liquid chromatography/ massОБМ – основной белок миелинаspectrometry (жидкостная хроматография/масс-ПААГ – полиакриламидный гельспектрометрия)ПНС – периферическая нервная системаMALDI-TOF - Matrix Assisted LaserПЭГ – полиэтиленглигольDesorption/Ionization time of flightСД1 – сахарный диабет первого типа(времяпролетная матрично-активированнаяСД2 – сахарный диабет второго типалазерная десорбция/ионизация)СТЗ – стрептозотоцинMHC – major histocompatibility complexТНС – тетразолий нитросиний(главный комплекс гистосовместимости)ТФУ – трифторуксусная кислотаMS - mass spectrometry (масс-спектрометрия)ФНО - фактор некроза опухолейNOD – none-obese diabetic (диабетические мышиФРН – фактор роста нервовбез ожирения)ЦНС – центральная нервная системаm/z безразмерная величина, отношение массы иЧСА – человеческий сывороточный альбуминзаряда ионаЭМГ – электромиографияТерминыОксиальбумин – коммерческий ЧСА, в котором содержится 0,4 М SH-групп в 1 М белка (0,4 М/М);Меркаптоальбумин – коммерческий ЧСА, в котором SH-группы восстановлены до 0,7 М в 1 Мбелка (0,7 М/М);Супероксиальбумин – коммерческий ЧСА, в которм SH-группы окислены до 0,2 М в 1 М белка (0,2М/М).5I.

ВведениеАктуальность работыСахарный диабет первого типа (СД1), или инсулинозависимый диабет являетсяаутоиммунным заболеванием, при котором разрушаются β-клетки поджелудочной железы. СД1— многофакторное заболевание, механизм возникновения которого до конца не изучен;известно, что его развитию могут способствовать такие факторы окружающей среды, каквирусы, токсины, стресс; так же играет роль генетическая предрасположенность. При данномзаболевании необходимы постоянный контроль содержания глюкозы в крови и коррекцияинсулинотерапии. Существующие на сегодняшний день маркеры гликемического контроля –содержание глюкозы и гликированного гемоглобина в крови – имеют ряд недостатков,вследствие чего требуется поиск дополнительных маркеров.СД1 характеризуется рядом осложнений, самым распространенным из которыхявляется дистальная полинейропатия (ДПН) - нарушение структуры и функции периферическихнервных волокон.

ДПН рассматривается как следствие ухудшения показателей компенсацииуглеводного обмена.Итак, ввиду гетерогенности заболевания, вероятности развития множественныхосложнений и необходимости тщательного гликемического контроля перед исследователямивстают задачи по поиску новых диагностических критериев и маркеров.Цель работыЦелью нашей работы стал поиск диагностических маркеров и отработка методологииих применения для выявления механизма развития СД1, оценки степени гликирования иокисления альбумина, выделенного из сыворотки крови пациентов с СД1 и для раннейдиагностики развития у них нейрональных осложнений.Задачи работыДля достижения этой цели были поставлены следующие задачи:1.Исследовать гликированный человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) in vitro:а) получить препараты ЧСА с различной степенью окисления и гликирования иопределить в них содержание кетоамина, карбонильных групп и SH-групп; также исследоватьспектры флуоресценции альбумина;б) проанализировать методом анионобменной ВЭЖХ степень окисления игликирования ЧСА;г) определить в гликированном ЧСА методом LC/MS сайты связывания глюкозы состатками лизина и аргинина.6Исследовать альбумин, выделенный из сыворотки крови детей с СД1:2.а) апробировать методику выделения альбумина из сыворотки крови детей с СД1 спомощью аффинной хроматографии на голубом аффи-геле и определить в нем содержаниекетоамина и SH-групп;б) проанализировать методом анионообменной ВЭЖХ степень окисления игликирования выделенного альбумина;3.Определить содержание проинсулина в сыворотке крови детей с СД1для оценки частоты встречаемости такого типа СД1, который отличен от аутоиммунного;4.Выявить наличие дистальной полинейропатии (ДПН) у детей с различными срокамиСД15.Определить аАТ к F(ab)2-фрагментам антиидиотипических аАТ к S100, ГФКБ, ОБМ иФРН в сыворотке крови детей с различными сроками заболевания СД1 и в контрольнойгруппе;6.Определить аутоантитела (аАТ) к белкам нейрональной ткани S100, ГФКБ, ОБМ иФРН в сыворотке крови крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином, а также аАТ кинсулину и уровень глюкозы в крови, как показателей деструкции β-клеток.Научная новизнаПроведено систематическое изучение влияния окислительного гликирования наразличные характеристики человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) in vitro в условияхнормо- и гипергликемии, а также при нефизиологической концентрации глюкозы с учётомособенностей коммерческого альбумина.