Маркеры, характеризующие гликемический статус и развитие нейрональных нарушений у пациентов с сахарным диабетом 1-го типа, страница 8

Объектом исследования был как коммерческийальбумин, модифицированный глюкозой in vitro [105, 158], так и выделенный из сыворотки илииз плазмы крови с помощью боронат-аффинной хроматографии [165, 170, 171] илихромотографии на голубом геле [172].Во многих работах, посвященных изучению структуры и свойств гликированногоальбумина, используется гликирование in vitro. Сильнее всего характеристики меняются принефизиологическом гликировании, поэтому многие исследователи используют при инкубациивысокую концентрацию глюкозы, превышающую нормальную в 300 и более раз [104, 158, 173].3.5.1. Влияние гликирования и окисления на структуру и свойства альбуминаБыли проведены обширные исследования структуры и свойств альбумина (БСА и ЧСА)при определенной степени гликирования.

Некоторые исследования показали тушениефлуоресценции триптофана Trp-214 (λвозбуждения=285), расположенного в области II, пригликировании альбумина вследствие локального разворачивания молекулы (увеличениягидрофильности) и сдвиг спектра флуоресценции в синюю область. В тоже время возрасталаспецифическая флуоресценция пентозидина (λвозбуждения=325). Метод кругового дихроизмапоказал увличение содержания β-слоёв и уменьшение α-спиралей. С увеличением степенигликирования возрастало содержание карбонильных групп и снижалось количество тиоловых с0,6 м/м до 0,3 м/м.

т.е. происходило окисление молекулы белка. Следует отметить, что35обсуждаемые результаты относятся к белку с большим количеством кетоамина, равном 5-12М/М белка [102, 158, 172, 174] в то время как у людей, в норме и при диабете, этот показательзначительно ниже. Так, при выделении альбумина из сыворотки здоровых доноров с помощьюПЭГ и определении кетоамина с помощью ТНС были получены референсные значения 0,270,37 М кетоамина на 1 М белка, а у больных диабетом 0,5 – 0,8 М/М [136].

Следует отметить,что в литературе много данных по процентному содержанию гликированного альбумина улюдей и крайне мало по молярным количествам кетоамина в альбумине.При исследовании связывающих свойств альбумина было обнаружено изменениесвязывания с лекарствами в результате гликирования [172, 175, 176]. Причём было выяснено,что гликирование ЧСА ингибирует связывание лигандов с сайтом II и не влияет на связывание ссайтом I [177].

Отмечалось снижение сродства к билирубину на 50%, к свободным жирнымкислотам — в 20 раз [104]. Немаловажную роль в снижении связывающих свойствгликированного альбумина играют аминокислотные остатки, модифицированные глюкозой.В то же время Yasukawa K. et al. показали, что ранняя стадия гликирования не влияет насвязывающие свойства альбумина, в то время как снижение связывания встречается придальнейшем гликировании [146]. Отношение HMA/HNA у пациентов с заболеваниями печенибыло смещено в сторону окисленной формы [86].

В работе Kawakami et al. окислениеальбумина было проведено просто инкубацией при 37°С в аэробных условиях. Было отмеченоуменьшение доли восстановленного альбумина с 70-80% до 55% [178].В метаболизме NO важное место занимает формирование S-нитрозоальбумина.Поскольку концентрация SNO-alb в плазме крайне мала по сравнению с альбумином, этамодификация не должна влиять на функции альбумина.Большинство исследований, посвященных способности альбумина в восстановленном иокисленном состоянии связывать различные лиганды, проводились in vitro.

Использовалисьразличные способы окисления белка: инкубирование с перекисью водорода, глюкозой,аскорбиновой кислотой в присутствии кислорода и ионов металлов, хлорамином Т, цистеиномили гомоцистеином, NO. Индикаторами окисленного статуса служили: количество SH-групп,соотношение фракций HMA и HNA, количество карбонильных групп, формированиетирозиновых димеров, содержание фруктозоамина, содержание S-нитрозо групп. Дляопределения связывания применяются различные методы, чаще всего вычисляется количествонесвязавшихся с белком веществ. Изменение связывающих свойств альбумина вследствиевоздействия различных агентов продемонстрированы в таблице 2.36Таблица 2.

Влияние гликирования и окисления альбумина на его связывающие свойства [86, 174].Способ модификацииаскорбиновая кислотаСвязываемый лиганд Сайт связывания изменениебиллирубинIаскорбиновая кислота /FeCl2±хлорамин Tгемодиализ↓±, ↓варфаринI↓глюкоза±, ↑гомоцистеин±гомоцистеинсалициловая кислотаэтакриновая кислотабиллирубинглюкозаII↓↑↓этакриновая кислотафенилбутазонI±глюкозафуросемидI↑глюкозадансиламидI±глюкозафенилбутазонI↓глюкозагомоцистеин±диазепамIIэтакриновая кислотаглюкоза↓±ибупрофенII↓дансилсаркозинII↓дансилпролинII↓L-триптофанIIглюкозафлуфенамовая кислотаII↓глюкозанапроксенII±глюкозамедьN-конец↓, ↑глюкозажелезоN-конец↑глюкозакаптоприлдругие сайты±глюкозажирные кислотыдругие сайты↓NOпальмитат?↑, ↓аскорбиновая кислотапрогестерон?↓цистинцефазолин?↓цистинверапамил?↑глюкозапеченочная недостаточностьглюкозаглюкозацистин↓, ±↓Как видно из таблицы 2, одни и те же модификации альбумина могут по-разному влиятьна его центр связывания, т.е. повышать, понижать, или не оказывать влияния на связывающиесвойства.

Так же, одно и то же вещество оказывает различное влияние на разные центрысвязывания.373.5.2. Исследование сайтов связывания с глюкозойВ ряде исследований были идентифицированы основные сайты альбумина, по которымвозможна модификация глюкозой. Было описано около 29 сайтов, из них 18 являлись остаткамилизина [174]. Основным сайтом называют Lys-525, т.к. примерно 33% от всего гликированияпротекает по этому положению [104, 165, 171]. По-видимому, это происходит из-за того, чтоположительнозаряженныеаминогруппыкатализируютперегруппировкуАмадоривопределенных сайтах.

Специфичность сайта Lys-525 заключается в последовательности LysLys, тогда как другие сайты находятся в последовательности Lys-His или Lys-His-Lys илипоблизости от дисульфидных мостиков, которые, вероятно, перемещают аминогруппы болееотдалённых частей белка ближе к этим сайтам [165]. Были четко установлены три другихостатка лизина в положениях 199, 281, и 489, но они вносят меньший вклад в общеегликирование, чем Lys-525 [174]. В таблице 3 перечислены модифицированные in vitro (прифизиологических условиях) и in vivo сайты лизина и аргинина.Некоторыми исследователями были определены КПГ, образующиеся в результатемодификации.Так,былообнаружено,чтоминимальногликированныйальбумин,приготовленный in vitro, в основном содержит фруктозил-лизин и карбоксиметил-лизин сминорным содержанием других КПГ; сильно гликированный альбумин, помимо прочих КПГ,содержал пирралин и большие количества фруктозил-лизина [167] (рис.

11). Анализ КПГ,содержащихся в белках плазмы (включая альбумин) здоровых доноров, показал, чтопревалирует группа гидроимидазолонов (рис. 17). В меньших количествах были обнаруженыкарбоксиметил-лизин, карбоксиэтил-лизин, перекрёстные сшивки пентозидина и производныеметилглиоксаля [179].Рисунок 17. Конечные продукты гликирования – группа гидроимидазолонов [84].38Таблица 3. Перечень сайтов ЧСА, модифицированных гликированием.УсловиягликированияIn vivoIn vivoIn vivoМетодопределенияИдентифицированныесайтыМеткатритием,боронат-аффиннаяхромотография,катион-обменнаяхромотография,аминокислотныйанализМеткатритием,боронат-аффиннаяхромотография,ВЭЖХ,аминокислотныйанализборонат-аффиннаяхромотография,LС-MSLС-MSОсновной сайт К525In vivo16In vivoInvitro(инкубацияплазмыс30мМглюкозой, 37 ºС, 24 ч.)In vitro (коммерческийминимальногликированный ЧСА)In vitro (коммерческийминимальногликированный ЧСА)In vitro (инкубация 0,1мМ ЧСА в условияхнормогликемии, 37 ºС,24 ч.)In vitro (инкубация 0,63мМ ЧСА в условияхгипергликемии, 37 ºС, 25 недель)О/18О-метка,фракционированиепептидов, MALDI–TOF MS12С/13С-метка,боронат-аффиннаяхромотография,LC–MS/MSпептидноефракционирование,MALDI–TOF MS16О/18О-метка,фракционированиепептидов, MALDI–TOF MSLC–MS/MSИсточник[171]Основной сайт К525, другиезначимые сайты K199, K233,K281, K439, K12, K317, K351,K534K524/K525, K162, K276, K359,K351,K233,K12,K51,K64,K174,K525, K233, K136/K137, K199,K64/K73, K439,K317, K274/K276, K534, K389K12, K162, K174, K190, K199,K205, K276, K281,K286, K313, K317, K372, K432,K525, K545, K557,K560, K564, K573/K574; R10,R98, R160, R197, R209,R428, R484, R485Основные сайты: K525, K240,K233, K51, K136,K137, K73; другие сайты: K41,K64, K93, K106, K159,K174, K181, K195, R218, K262,K274, K323, K359,K372, K378, K389, K402, K413,K432, K436, K439,K444, K466, R472, K475, K500,K519, K573,K51, K137, K162, K225, K233,K276, K313, K323,K351, K378, K413, K444, K525,K536, K545, K573K12, K51, K159, K199, K205,K286, K378, K439, K525, K538;R160, R222, R472K159, K212, K323, K413, K432,K439, K525;R81, R114, R218[165][180][181][84][182][114][183]R410, R114, R186, R218, R428[184]фракционированиепептидов, MALDI–TOF MSОсновныесайты:K525/K524/R521, N-конец,K93/R98,K276/K286,K414/K439, R197, K199,K281, R428; другие сайты: K4,K12, K174, K190, K205,K212, K262, K313, K317, K413,K545, K557, K560,K564, K573, K574; R10, R186,R209, R410[168]39Как следует из табл.

3, результаты, полученные разными авторами, существенноразличаются. Это касается как количества сайтов гликирования, так и положения лизинов,участвующих в реакции гликирования. Причиной могут быть различные условия гликирования,например концентрация глюкозы или длительность проведения реакции, а также использованиепрепаратов ЧСА, которые различаются, например, количеством аминокислотных остатков илистепенью окисленности. Помимо лизина и аргинина, тиольные группы цистеиновых остатковтакже являются мощным нуклеофилом, и могут быть гликированы. При модифицированииметилглиоксалем in vitro были показаны КПГ, например - S-карбоксиметил-цистеин [185].Предполагаемый механизм формирования этого продукта изображён на рис.

18.Рисунок 18. Структура и предполагаемый механизм формироания S-карбоксиметил-цистеина [185].Участие Cys-34 в формировании этого продукта, а также S-карбоксиэтил-цистеина,было подтверждено in vivo (в плазме пациентов с диабетом) [186].III. Экспериментальная часть1. Исследование альбумина in vitro и в сыворотке кровиВ исследовании использовали ЧСА (Sigma A1653, США) и глюкозу (Cerestar Iberica,Испания).Гликирование в физиологических условияхДля гликирования использовали два препарата ЧСА:1) Окисленный (оксиальбумин, содержит 40% сульфогрупп) – препарат Sigma безобработки;2) Восстановленный (меркаптоальбумин, содержит до 70% сульфогрупп) – препаратSigma, обработанный дититриитолом (3 мМ дитиотриитола, 40 мг/мл ЧСА, 30 мин.при 37°С).