Диссертация (Химический состав и биологическая активность гидрофильных фракций из соцветий бархатцев распростертых), страница 14

Содержание животных осуществлялось встандартных условиях вивария. Диета животных соответствовала всем принципамполнорационного сбалансированного питания для лабораторных животных(мышей и крыс) в соответствии с ГОСТ Р 50258-92 (производства ООО «Мэст»,Москва). Содержание животных и выполнение экспериментов проводилосьсогласно правилам лабораторной практики (GLP) при проведении доклиническихисследований в Российской Федерации ((ГОСТ З 51000.396 и 51000.4-96)Международным рекомендациям Европейской конвенции по защите позвоночныхживотных, используемых при экспериментальных исследованиях.116Отбор животных осуществлялся с учетом пола, возраста, веса и уровнягликемии. Путем рандомизирования они были подразделены на следующиегруппы по 15 животных в каждой:1.рана (животные без сахарного диабета (СД) с плоскостнойповерхностной раной – интактная группа);2.рана + СД + физиологический раствор (негативный контроль – НК);3.рана + СД + Актовегин (препарат сравнения);4.рана + СД + Э-40%Et.Экспериментальныйсахарныйдиабет(ЭСД)вызываливведениемстрептозотоцина в дозе 45 мг/кг внутривенно в хвостовую вену.

Контрольгликемии производили через 72 часа. Для дальнейших этапов экспериментаотбирали животных с уровнем сахара в крови 12-15 ммоль/л. После анализауровня гликемии и распределения животных по группам на 3 сутки в условияхоперационной у наркотизированных животных моделировались плоскостныеповерхностные раны.

Операционное поле предварительно дэпиллировали, ранынаносились в межлопаточной области по специальному трафарету с соблюдениемвсех правил асептики, скальпелем путем иссечения кожи размером 20 × 30 мм(600 мм2 по методике Слуцкого Л.И.). Изучаемая субстанция вводилась с первогодня моделирования ран в течение трех недель перорально в дозе 100 мг/кг.Физиологический раствор контрольной группе вводился по аналогичной схеме вэквивалентном объеме.На 7, 14, 21 сутки были проведены планиметрические измерения. Заранее наторсионных весах определялся вес 1 см2 кальки.

Для измерения площади раны напоследнюю накладывали отмытую рентгеновскую пленку и на ее обратнойстороне обводили контуры раны. Полученный рисунок переносили на кальку, азатем вырезали «контур раны» и взвешивали. Полученный вес делили на вес 1 см2кальки.Статистическую обработку результатов проводили с использованиемпрограмм: MS Excel 2007, GraphPad Prism 6. Различия между группами выявляли117сиспользованиемкритериевКраскела-УоллисаиНьюмена-Кейлса.Статистически значимыми принимались различия при p 0,05 [24].Результаты исследованияВ ходе исследования было выявлено существенное снижение в динамикезаживления ран при исследовании группы животных с сахарным диабетом посравнению с интактной группой.

Так, в группе животных с экспериментальнымСД раневая поверхность была больше в 1,5 и почти в 8 раз по сравнению сгруппой интакт на 14 и 21 сутки соответственно. Возможно, это объясниморазвивающейся на фоне СД эндотелиальной дисфункцией и снижением синтеза ивыделения оксида азота, ответственного в норме за обеспечение локальнойвазодилатации,микроциркуляции,антимикробногоэффекта,антитромботического действия и обеспечения местного иммунитета.ПрепаратсравненияАктовегиноказалблагоприятноевлияниеназаживление раневой поверхности у крыс.

Раневой дефект сократился на 21 суткипочти в 6 раз и был меньше на 21% и 48% на 14 и 21 сутки относительно группыконтроля с СД (рисунок 52, таблица 43).350300мм2250рана200рана+СД150рана+СД+Актовегин100рана+СД+Э-40%Et500исход7 суток14 суток 21 суткиРисунок 52 – Динамика изменения планиметрических показателей поверхностныхран у крыс с ЭСД118Таблица 43 – Планиметрические показатели поверхностных ран у крыс сэкспериментальным сахарным диабетомГруппаИсход7 суток14 суток21 суткиРана300183,3118,113,2Рана+СД300256,1178,0104,5Рана+СД+Актовегин300240,9144,650,3Рана+СД+Э-40%Et300208,1127,97,8Применение Э-40%Et обусловило сокращение раневой поверхности в 38 разотносительно исхода, а также раневая поверхность была меньше на 16% на 21сутки относительно группы сравнения СД + Актовегин.

Более быстраярегенерацияможетбытьобусловленаулучшениемфункцииэндотелия,улучшением его вазодилатирующей и антитромбической функции, улучшениеммикроциркуляции и трофики тканей, антиоксидантными эффектами Э-40%Et,снижением цитотоксичности пероксинитрита и, соответственно, улучшениемлокальной микроциркуляции в ране и снижением явлений ишемии.Данные, полученные в результате исследования, демонстрируют не тольковыраженную ранозаживляющую активность у Э-40%Et, но и позволяютпредполагать наличие комплексного действия на патогенетические звенья при СД[24].6.3 Изучение влияния Э-40%Et на вазодилатирующую иантитромботическую функции эндотелия сосудов головного мозгаМатериалы и методы исследованияИсследование реализовано на 40 крысах – самцах линии Wistar, массой 220– 240 грамм, разделенных на 4 группы по 10 особей, полученных из виварияПятигорскогомедико-фармацевтическогоинститута(Пятигорск,Россия).Содержание, и все проводимые с животными манипуляции осуществляли всоответствии с требованиями Европейской конвенции по защите позвоночныхживотных, используемых для экспериментальных и других научных целей(Strasbourg, 22 June, 1998).Первую группу составили ложнооперированные животные (Л/О).119Вторая группа крыс – группа НК (ОПСМА) с фокальной ишемиейголовного мозга.Фокальнуюправостороннейишемиюокклюзииголовногосреднеймозгамозговойвоспроизводилиартерии.путемОперативноевмешательство проводили под хлоралгидратной анестезией (350мг/кг).

Напредварительно депилированной коже (участок 2 см2 ниже и правее глаза) делалинадрез. Затем разделяли мышцы, удаляли отросток скуловой кости. Специальносконструированным бором делали трепанационное отверстие в черепной коробкедиаметром 2 мм над местом пересечения средней мозговой артерии (СМА) собонятельным трактом. Затем с использованием десмокоагулятора собственнойконструкции осуществляли коагуляцию (пережигание) СМА, под местом еепересечения с обонятельным трактом. Костные обломки удаляли, мягкие тканивосстанавливали.

Шов обрабатывали 5% раствором йода [26,70].Двум оставшимся группам крыс вводили per os исследуемые соединения –ATACL (производное коричной кислоты: 4-гидрокси-3,5-дитретбутил коричнаякислота) Э-40%Et в дозе 100 мг/кг за 60 минут до моделирования ишемии и напротяжении 3 дней ишемического периода.Группа НК получала 0,9 % раствор натрия хлорида в эквивалентном объеме.По истечении указанного времени проводили оценку вазодилатирующей иантитромботической функций эндотелия сосудов головного мозга крыс.Оценку вазодилатирующей функции эндотелия сосудов головного мозгакрыс проводили с использованием допплерографического метода (регистрацияСК (средней систолической скорости) в проекции СМА) при модификациисинтезаэндогенногооксидаазота.Среднююсистолическуюскоростьрегистрировали с помощью ультразвукового допплерографа [26].

В качествемодификаторов синтеза оксида азота использовали: ацетилхолин (АЦХ) 0,1 мг/кг(Sigma-Aldrich), L-аргинин 150 мг/кг (Panreac), нитро-L-аргинин метиловый эфир(L-NAME) 15 мг/кг (Sigma-Aldrich). Все используемые тест-системы вводилисьвнутривенно в левую бедренную вену, непосредственно в процессе регистрациикровотока. После выполнения всех необходимых исследований животные120выводились из эксперимента путем мгновенной декапитации до выхода изнаркоза [106].Оценкуантитромботическойфункцииэндотелияосуществлялипоспособности тромбоцитов к агрегации [23,26].Результаты изучения вазодилатирующей и антитромботической функцииэндотелиясосудовголовногомозгаобрабатывалистатистическисиспользованием прикладных программ [26].Результаты исследованияУ Л/О исходная скорость локального мозгового кровотока составляла 5,099± 0,69 см/сек.

В результате окклюзии правой средней мозговой артерии средняясистолическая скорость (СССк) статистически достоверно снижается у группыНК в 2,1 раза, у животных, получавших производное коричной кислоты (ATACL)и Э-40%Et в 2,23 и 2,02 раза (p>0,02) соответственно.ВнутривенноевведениеАЦХ–фактора,стимулирующегосинтезэндогенного NO, вызвало существенное увеличение СССк у Л/О группыживотных. Прирост кровотока составил порядка 49,1% (p>0,05) относительноисходных показателей скорости кровотока данной группы крыс (рисунок 55), в товремя как у животных группы ОПСМА увеличение скорости локальногомозгового кровотока при введении АЦХ составило лишь 16,2 %.

При примененииисследуемых соединений наблюдалась тенденция к сохранению способностисосудов головного мозга к дилатации на фоне внутривенного введения АЦХ.Прирост СССк, при введении АЦХ, составил 44,2 % и 26,8 % (p>0,01) (рисунок )при применении ATACL и Э-40%Et соответственно. Таким образом, приприменении исследуемых соединений наблюдается более выраженный ответ(прирост кровотока) на стимулированный АЦХ синтез NO относительно группыживотных с правосторонней окклюзией средней мозговой артерии, которые неполучали ATACL и Э-40%Et. Это свидетельствует о значительно меньшихструктурных изменениях в эндотелии сосудов головного мозга крыс и наличии уисследуемых соединений эндотелипротекторного действия.121Введение L-аргинина не оказало существенного влияния на изменениескорости локального мозгового кровотока у Л/О животных (рисунок 53).