Диссертация (Химический состав и биологическая активность гидрофильных фракций из соцветий бархатцев распростертых), страница 13

Растворы дляпроведения испытания, а также расчет степени ассоциации и коэффициентараспределения осуществляли по вышеописанной методике. Результаты испытанияприведены в таблицах 41, 42.Таблица 41 – Изменение концентрации растворов ПВ после установленияэкстракционного равновесия при различных значениях рН средыС,%1/R1∙103Ом-1∙см-1,(рН = 3,7)1/R1∙103Ом-1∙см-1,(рН = 2)0,60,81,01,271,711,984,284,627,211/R2∙1031/R1∙103-1-1Ом ∙см , Ом-1∙см-1,(рН = 2,(рН = 8)рафинат)0,380,3980,670,92,292,671/RNaOH∙103Ом-1∙см-1,(рН = 8,рафинат)0,00920,230,27С1, %С1, %(рН = 2) (рН = 8)0,0490,0740,0930,0060,080,1Таблица 42 – Результаты определения коэффициента распределения ПВ в системевода - н-октанол при различных значениях рН средыКоэффициентМетрологическиераспределения, K характеристики0,218вода очищенная –н-октанол2,50,163Кср = 0,164(pH 2)0,1170,207вода очищенная –н-октанол6,70,720Кср = 0,376(pH 8)0,202Экспериментальные данные о влиянии на распределение рН средыСредаСтепеньассоциации, nпоказали, что лучшее распределение ПВ из водного слоя в органический слойпроисходит в условиях кислотной реакции среды (рисунок 50).109Коэффициент распределения9876вода-диэтиловый эфир5вода-октанол4вода-октанол (pH 8)3вода-октанол (pH 2)210Рисунок 50 – Диаграмма зависимости коэффициента распределения от условийэкстракцииСледовательно, можно предположить, что ПВ из шрота соцветий бархатцевв кислой среде желудка всасываться и распределяться будут лучше, чем вщелочной среде кишечника.Показано, что процесс перехода ПВ в органический слой (н-октанол) носитэкзотермический характер (∆Н° 0).

В изменение изобарно-изотермическогопотенциала вклад энтальпийной составляющей больше, чем энтропийногофактора и поэтому ∆G° 0, что свидетельствует о самопроизвольности процессараспределения ПВ, выделенных из шрота соцветий бархатцев распростертых,полярной фазы в неполярную. При этом использование активаторов процесса нетребуется.Определение величин коэффициентов распределения исследуемых веществв различных системах и их зависимость от кислотности среды позволитпрогнозировать возможность проникновения их через биологические мембраны.110Выводы по главе 51.

Из шрота соцветий бархатцев, остающегося после получения Э-40%Et,выделены ПВ. Выход составил 2,2%.2. В результате проведенных исследований вискозиметрическим методомопределена средняя молярная масса ПВ, равная 45272 г/моль. Установленаконстанта Хаггинса (1,46), связанная с невысокой растворимостью ПВ в воде.Установлено,распростертых,чтоПВ,являютсявыделенныеизшротасоцветийповерхностно-активными.бархатцевПоказано,чтомакромолекула ПВ может находиться в состоянии полиамфиона при pH = 4,7.3. Выявлена достаточно высокая комплексообразующая способность ПВ поотношению к ионам свинца. Степень связывания составляет 29,2%.Сорбционный процесс описывается уравнением Ленгмюра.4. Установлено, что лучшее распределение ПВ из водного слоя в органическийпроисходит в системе растворителей вода очищенная – н-октанол в кислойсреде.111Глава 6 О фармакологической активности извлечения, полученногоэкстракцией спиртом этиловым 40% соцветий бархатцев распростертых(Tagetes patula L.)1Основные направления фармакологических исследований: на кафедре фармакологии и биофармации ФГБОУ ВО ВолгГМУ МинздраваРоссии под руководством профессора, доктора медицинских наук, член-корр.РАН Ивана Николаевича Тюренкова было изучено ранозаживляющеедействие извлечения, полученного из соцветий бархатцев распростертыхэкстракцией спиртом этиловым 40% (далее Э-40%Et); на кафедре фармакологии с курсом клинической фармакологии ПМФИ –филиала ФГБОУ ВО ВолгГМУ Минздрава России под руководством докторамедицинских наук Андрея Владиславовича Воронкова изучено влияниеЭ-40%Et и патулетина на вазодилатирующую и антитромботическую функцииэндотелия сосудов головного мозга крыс в условиях его фокальной ишемии.1Примечание: участие автора при выполнении фармакологических исследований заключалось в подготовке проб,наблюдении за поведением подопытных животных, а также обсуждении и интерпретации полученных результатов.1126.1 Изучение антиоксидантной активности Э-40%Et в отношении радикаловна различных модельных средахМатериалы и методы исследования.Нитрозил-радикал модельная среда.Установлено, что нитропруссид натрия разлагается в водном растворе прирН (7,2 - 7,4) с образованием NO*.

В условиях оксигенации NO* реагирует скислородом с получением в качестве продуктов реакции нитрата и нитрита,количество которых может быть определено реактивом Грисса [147]. При этомдля генерации NO*-радикала инкубационная среда включает в себя: 2 мл 10 мМраствора нитропруссида натрия, и 0,5 мл фосфатного буфера (рН 7,4).

С цельюизучения анти-NO-радикальной активности в среду раздельно вносили по 0,5 млраствора изучаемого Э-40%Et в концентрации эквивалентной дозе 100 мг/кг дляпероральноговведения,растворэтилметилгидроксипиридинасукцината(Мексидол, ФАРМАСОФТ (Россия)) в концентрации эквивалентной 30 мг/кг дляприменения per os и 1% раствор аскорбиновой кислоты (Sigma-Aldrich) [127].Полученные модельные смеси термостатировали 15 мин при 25 °С. Послеинкубации аликвотировали 0,5 мл среды и смешивали с 0,5 мл реактива Грисса.Затем смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин ирегистрировали величину оптической плотности полученного раствора при 546нм (спектрофотометр ПЭ-5300В).

Процент ингибирования образования нитрозилрадикала рассчитывали по формуле 28:%NO* =(A0 - A1) x 100 ,A0(28)где A0 – оптическая плотность смеси перед реакцией;A1 – оптическая плотность смеси после реакции с реактивом Грисса.Супероксид-радикал модельная среда.Генерацию супероксидного радикала осуществляли путем фотообращениярибофлавина, которое регистрировали восстановлением тетразолия нитро-синего(ТНС). Измерение проводили на основе метода, описанного Winterbourn [146].113Аналитическая смесь содержала: 0,1 мл 1,5 мМ раствора ТНС, 0,2 мл ЭДТА (0,1М), 0,05 мл рибофлавина (0,12 мМ) и 2,55 мл фосфатного буфера (рН 7,4).

Вреакционную среду добавляли по 0,5 мл исследуемых растворов (см. выше) иинкубировали при 25°С в течении 5 мин, затем измеряли оптическую плотностьполученной смеси при 560 нм против контрольной пробы, содержащей вместоиспытуемых растворов 0,5 мл фосфатного буфера. Процент ингибированияобразования супероксидного радикала рассчитывали по формуле 29:%O2-* =(A0 - A1) x 100 ,A0(29)где A0 – оптическая плотность контрольной пробы;A1 – оптическая плотность опытной пробы.Fe2+ - хелатирующая модельная среда.За основу для проведения анализа был принят метод Benzie & Strain [128].Принцип основан на образовании комплекса о-фенантролин ↔ Fe2+ и егоразрушениив присутствиихелатирующихагентов. Реакционную смесь,содержащую 1 мл 0,05% о-фенантролина в метаноле, 2 мл железа хлорида (II)(200 мкМ) и 2 мл испытуемых растворов (см. выше), инкубировали прикомнатной температуре в течение 10 мин и измеряли оптическую плотностьполученной смеси при 510 нм (в контрольную пробу вносили 2 млбидистиллированной воды).

Хелатирующую способность испытуемых раствороврассчитывали по формуле 30:%Fe2+ =(A0 - A1) x 100 ,A0(30)где A0 – оптическая плотность контрольной пробы;A1 – оптическая плотность опытной пробы.Результаты опытов обрабатывали методом вариационной статистики.Вычисляли среднее значение и стандартную ошибку среднего значения.Достоверность различий между средними оценивалась с использованием t-114критерия Стьюдента. В работе применяли пакет статистического анализа MSExcel 10 версии.Результаты исследованияПриоценкеанти-NO-радикальнойактивностиизучаемогоЭ-40%Etустановлено, что он ингибировал образование NO* на 37,3% (рисунок 51), в товремя как Мексидол подавлял образование данного свободного радикала на43,5%, а аскорбиновая кислота на 32,6%.

Таким образом, по способноститерминировать образование NO* Э-40%Et уступал Мексидолу (на 16,4% (p<0,05))и превышал аскорбиновую кислоту (на 14,4% (p<0,05)).Анализируя данные, полученные при оценке способности Э-40%Etпрепятствовать образованию супероксидного радикала, установлено, что онподавлял генерацию данного радикала на 40,2%, что статистически значимо неотличалось от показателей Мексидола (45,5%) и аскорбиновой кислоты (37,3%)(рисунок 51).Примечание: *- статистически значимо относительно мексидола (p<0,05);#- статистически значимо относительно аскорбиновой кислоты (p<0,05).Рисунок 51 – Влияние экстракта Э-40%Et на генерацию нитрозильного исупероксидного радикалов, а также стабильность Fe2+↔фенантролиновогокомплексаПо способности дестабилизировать комплекс о-фенантролин ↔ Fe2+ Э40%Et превосходил Мексидол (процент разрушения данного комплекса придобавлении в модельную среду Э-40%Et составил 30,7%, а при внесении115Мексидола 27,3%).

В сравнении с аскорбиновой кислотой Э-40%Et проявлялменее выраженные хелатирующие свойства (процент терминации образованияхелатного комплекса о-фенантролин ↔ Fe2+ при внесении в среду аскорбиновойкислоты составил 35,4%). При этом следует отметить, что статистическизначимых различий между экспериментальными сериями не выявлено.В результате проведенного исследования установлено, что Э-40%EtпроявляетантирадикальныесвойстваиFe2+-хелатирующуюактивность,сопоставимые по величине с эффектом Mексидола и аскорбиновой кислоты.Наличие у изучаемого Э-40%Et прямой антиоксидантной активности, а такжежелезо-связывающих свойств может лежать в основе способности даннойсубстанции подавлять развитие оксидативного стресса, также препятствоватьFe2+-зависимому перекисному окислению липидов, что в свою очередь делаетданную субстанцию перспективным объектом для дальнейшего изучения с цельюполучения средства, проявляющего антиоксидантные свойства.6.2 Влияние Э-40%Et на заживление ран у крыс с экспериментальнымсахарным диабетомМатериалы и методы исследованияИсследование было выполнено на 60 белых крысах-самцах линии Wistar(возраст 6 месяцев, масса 200-220 г).