Пташне - Переключение генов - 1988, страница 26

Такие гены найдены у человека, грызунов и дрожжей. Рассмотрим в качестве примера дрожжевой ген 6А1.1- один из генов, обеспечивающих рост дрожжей на галактозе. Примерно за 250 пар оснований до этого гена расположен участок, который обозначается РАБ (от англ. 11рзГгеат Асбкайпд Яеццепсе-последовательность, активирующая ген 6АЕ. и расположенная до него). Связавшись с 11Аэо, белок СхА1 4 запускает транскрипцию, идущую с начальной точки гена бАЬ1.

Если поместить УА5 за целых 600 пар оснований до другого дрожжевого гена, этот ген включится под действием СхАЕ 4. Как осуществляется такое дальнодействие? Следует ли нам использовать те данные, которые были получены при изучении фага Х, или мы должны привлекать новые идеи? При изучении фага Х были выяснены два основополагающих молекулярных механизма, обеспечивающих действие белков — активаторов транскрипции. Первый из них описывает взаимодействие регуляторных белков с ДНК, второй-активацию транскрипции гена под действием регуляторного белка, связанного с ДНК.

Мы утверждаем, что оба этих механизма приложимы к регуляции экспрессии генов у других организмов, в том числе у эукариот. Во-первых, регуляторные белки узнают специфические последовательности оснований в ДНК благодаря взаимодействию комплементарных поверхностей. В тех случаях„которые были подробно рассмотрены в этой книге, белки содержат выступающие а-спирали, которые располагаются в большом желобке ДНК и образуют специфические контакты с экспонированными химическими группами ДНК.

Нам известно, как узнает ДНК еще один белок. В данном случае речь идет не о регуляторе транскрипции. а о ферменте, который расщепляет ДНК по строго определенным последовательностям. Этот ыэ бактериальный белок Есо В! содержит выступающие а-спирали, которые укладываются в большие желобки молекулы ДНК. В деталях механизм узнавания отличаегся от описанных нами примеров, но, как и в случае ).-репрессора, конформации белка в целом комплементарна конформации обычной двухцепочечной ДНК. Хотя при связывании этого белка конформация спирали несколько нарушается, никаких радикальных изменений не происходит.

Некоторые эукапиогические регуляторные белки, в том числе ОА!.4, удалось выделить и показать, что они связываются )п гйго со специфическими последовательностями ДНК. Хотя у нас нет полного представления о том, как эти белки взаимодействуют с ДНК, нет никаких оснований полагать, что они используют при этом какие-либо другие приспособления помимо структур, выступающих из белковой глобулы и комплементарных обычной двойной спирали ДНК. В тех случаях, когда удалось измерить сродство этих белков к их операторным участкам, оно оказалось сравнимым со сродством ).-подобных регуляторных белков к их операторам.

Аминокислотные последовательности некоторых белков (но не всех) позволяют предположить, что при узнавании они используют биспиральный элемент, подобный таковому в белках фага ),. В одном случае при связывании регуляторного белка генов теплового шока Вгоюр)п!и он кооперативно связывается с двумя соседними участками ДНК. При этом энергетика связывания на удивление близка к связыванию ).-репрессора с Оя! и 0„2, что, по-видимому, является простым совпадением. Еьце один случай- активаторы транскрипции 5Я-генов, кодирующих небольшую РНК Хелорих /аеик. Здесь несколько белков, каждый из которых обладает примерно таким же сродством к ДНК, как и ).-репрессор, кооперативно связываются и образуют комплекс, который остается стабильным практически до бесконечности (см.

работы 1" 1, 2, 5, 8, 9, 12, 14, 15„17, 19, 20, 21, 22)). Во-виюрых, связанные с ДНК активаторы транскрипции включают ген, соприкасаясь с другими белками. Например, связанный с ДНК )-репрессор активирует транскрипцию, вступая в контакт с РНК-полимеразой и помогая ей связаться с прилегающим промотором и начать транскрипцию. Можно представигь себе альтернативный механизм, согласно которому белок изменяет структуру ДНК в месте связывания и вблизи него.

Если бы механизм активации заключается в изменении структуры ДНК, это изменение должно было бы каким-то образом распространяться до участка начала транскрипции. Такое изменение структуры области начала транскрипции в свою очередь необходимо для связывания РНК-полимеразы и начала транскрипции. ВАЗя Внпючен Ьех А оператор Включен ИАЗ Выключен Рис А 2. Три эксперимента по изучению регуляции генов у дрожжей Вверху белок ОАЕ4, свазываясь с участком сЗАВо, включает транскрипцию гена ОАь1, которая начинается за 250 Ьр до нез о.

Предполагается, что белок ОАЕ4 состоит нз двух доменов, один из которых, Х-концевой, контактирует с ДНК. В середине действие гибридного белка, содержащего в качестве С-концевого домена белок ОА1.4 и Н-концсвозо . бактериальный репрсссор 1.ехА. Такой белок, ЕсхА-ОАЕ4, связывается с оператором /ехА, встроенным перед дрожжевым геном, и включает этот ген. Внизу Х-концевой домен ОА14 тоже способен связываться с участком ЮАВгз, но не может включать транскрипцию, Рисунок существенно упрощает ситуацию: здесь не учтено, что ГЗАВо состоит из четырех участков связывания ОАЕ.4. Связывается ли ОА1.4 в виде димера и состоит ли он только из двух доменов, неизвестно.

Однако мы уже говорили о том, что при связывании репрессора с ДНК не происходит никаких радикальных изменений ее структуры. Более того, мутации, в результате которых изменяются аминокислоты на соответствующей поверхности репрессора и подавляется его стимулирующая активность (так называемые рс-мутации), не оказывают никакого действия на связывание с ДНК. Существование таких рс-мутантов подтверждает, что само по себе связывание репрессора с ДНК недостаточно для активации т.ена. Недавно мы провели эксперименты (их иллюстрирует рис. А,2), показавшие, что, как и Х-репрессор, белок СзАБ4 выполняет две разные функции: связывается с ДНК и осуществляет позитивную регуляцию.

Более того, в этом последнем случае их можно разграничить. Ф Белок ОАБ4 был модифицирован: его М-концевые остатки были заменены Х-концевым доменом бактериального 145 ю ~ззз репрессора 1.ехА. В общих чертах белок 1.ехА напоминает Х-репрессор, и его Х-концевой домен взаимодействует с lех.4-оператором. Гибридный белок, который можно синтезировать в дрожжевых клетках, связывается с оператором 1ехА, но не с УАо . Если встроить 7ехА-оператор перед каким-либо дрожжевым геном, белок свяжется с ним и включит транскрипцию этого гена.

Немодифицированный репрессор ЬехА, который тоже можно синтезировать в дрожжевых клетках, такого действия не оказывает. явБыл сконструирован белок — производный ОАЬ4, аналогичный рс-мутантным формам Х-репрессора. Он состоит просто из 98 1Ч-концевых аминокислот ОАЬ4 и связывается с четырьмя участками УАэ длиной по 17 пар оснований, но не способен активировать транскрипцию. И здесь, как и в случае Х-репрессора, одного связывания с ДНК недостаточно для активации гена.

Наши эксперименты с ОА1.4 показывают, что, связываясь с ДНК, он, подобно Х-репрессору, инициирует транскрипцию, соприкасаясь с какой-то другой молекулой, по-видимому с другим белком. Каким же образом ОАЬ 4, связанный с УА5о, может активировать процесс, который начинается на расстоянии нескольких сотен пар оснований? Возможно, ОАЬ4 помогает какому-то белку связаться рядом с собой. Этот белок может раскручивать ДНК, и таким образом область вблизи начала гена становится более доступной для связывания других белков и полимеразы. Альтернативная возможность состоит в том, что этот белок связывается рядом с ОАЬ4, а затем каким-то образом перемещается вдоль спирали по направлению к началу гена, где он сам начинает транскрипцию или помогает связыванию полимеразы.

Я придерживаюсь другой точки зрения. Суть ее в том, что ОАЬ4, связанный с УАэо, вступает в непосредственный контакт с другим белком, связанным с областью начала транскрипции, и таким образом помогает РНК-полимеразе связаться и начать транскрипцию. Согласно этой гипотезе, ДНК между 1УАо . и началом гена образует петлю, возможно заполненную другими белками.

Для этого ДНК должна быть достаточно гибкой, чтобы соприкосновение удаленных друг от друга белков не требовало больших энергетических затрат. Один из вариантов предлагаемой модели состоит в том, что во взаимодействии между ОАЬ4 и вспомогательным регуляторным белком, связанным вблизи начала транскрипции, участвуют один или более дополнительных белков.

Благодаря этому ДНК может изгибаться в меньшей степени. Известен ряд примеров бактериальных регуляторных белков, изгибающих двойную спираль ДНК, В этих случаях ДНК частично наматывается на эти белки. Мы предполагаем, что Х-репрессор изгибает двойную спираль другим способом. мб 1'ис. А.З. Проявление кооперативного аффекта на расстоянии. Димеры х-рспрессора связываюгся с двумя участками ДНК, которые разлелены шестью вгиками двойной спирали.

Молекула ДНК плавно изгибается, и С-кондовые домены репрессоров приходят в соприкосновение. Представим себе два операторных участка, один из которых обладает меньшим сродством к репрессору„чем другой (например, Ок) и Ок 2), и разделенных пятью или шестью витками спирали (имеется в виду расстояние между центрами операторных участков). Репрессор кооперативно связывается с этими участками — точно так же, как и в случае, ко~да они находятся на обычном расстоянии в два витка.

Другими словами, сродство к участку слабого связывания увеличивается, если в составе той же ДНК имеется участок сильного связывания. Как и в случае, когда участки сближены„выделенные )ч)-концевые домены связываются некооперативно. Эксперименты с ).-репрессором позволяют предположить, что димеры связываются кооперативно с двумя удаленными друг ог друга участками, ДНК изгибается и С-концевые домены сближаются (рис.