Пташне - Переключение генов - 1988, страница 24

Для удобства мы будем говорить о конкретном белке — Х-редрессоре, хотя основные положения носят общий характер. Более глубокое и детальное обсуждение проблемы можно найти в статьях, перечисленных в конце этого приложения. Резюме Доля времени, в течение которого оператор бывает связан с репрессором. определяется двумя факторами: сродством репрессора к оператору и концентрацией репрессора, доступного для взаимодействия с оператором. При данном уровне сродства чем выше концентрация репрессора. тем вьпие степень заполнения оператора. Количество свободного репрессора в клетке может значительно уменьшаться за счет его взаимодействия с неоператорными участками.

Один нз способов увеличения эффективности специфического связывания репрессора состоит в том, чтобы вместо одного операторного участка использовать два нли более участков, с которыми репрессор связываегся кооперативно. Специфическое и песпецифическое связывание Рассмотрим культуру бактериальных клеток, которые содержат одинаковое число молекул репрессора н одни оператор. Какая часть операторов связана с репрессором в каждый данный момент времени? Будем рассматривать наши клетки так, как будто онн представляюг собой одну большую клетку.

в которой концентрация операторов и репрессоров такая же. как в отдельных клетках. В равновесии взаимодействие репрессоров и операторов 134 характеризуется константой диссоциации Ко, которая оп- ределяется как (2) ОК=О+ К, Ко, =— (к] (О] (ок] где ! к] и ! О]--концентрация несвязанных (свободных) репрессора и оператора соответственно, (ОК]-концентрация комплексов репрессор- оператор. Чтобы оценить долю операторов, занятых репрессором при данной концентрации последнего, выведем уравнение, которое прямо даст нам долю операторов, свободных от репрессора.

Пусть !От] — суммарная концентрация оператора, !О] — концентрация свободного оператора, !ОК] — концентра- циЯ свЯзанного опеРатоРа; тогда (От] = (О] + ! Ок]. подставляя выражение для (ОК] из уравнения (1), получаем ГО] Ко. Кое = — при гк]» к„,. ГОт] Ксг + ГК] ГК] Посмотрим теперь, как выполняется это уравнение, на реальном примере.

Пусть в одной клетке Е. со!~ содержится 100 копий репрессора. Тогда его концентрация составляет примерно 1О ' М. Концентрация одного оператора в клетке равна примерно !О ' М. Констангу равновесия К примем равной !О 'о М. Репрессор находится в большом избытке по отношению к оператору, поэтому (К] = (Кт], где [Кт] — суммарная концентрация репрессора в клетке, Кроме того, !Кт]» Кор и мы можем использовать упрощенную форму уравнения (2): Ю] ~~ОР 10 — 3 (3! Го ] Гк ] 10 Отсюда следует, что в каждый данный момент времени 99,9'Ъ всех операторов занято репрессором. Или. другими словами, каждый оператор занят 99,9',4 времени.

Приведенные вычисления не учитывают тот факт, что белки, которые прочно связываются со специфическими операторными участками. обладают также низким, но все же не пренебрежимо малым сродством к неоператорным участкам ДНК. Такое связывание с неспецифическими последовательностями ДНК может приводить к заметному снижению концентрации свободного репрессора и, следовательно, доли связанных операторов. Далее мы всюду будем считать, что репрессор обладает одинаково низким сродством к любому неоператорному участку ДНК. В действительности может оказат.ься, что в неспецифическом связывании участвуют главным образом последовательности, которые отчасти напоминают оператор, но это не повлияет на наши основные выводы, !35 (5) 33б Константа равновесия К„для взаимодействия репрессора с неоператорными участками ДНК определяется как Р+ й Ко= [Р) [Щ [РЩ (4] где [Р) -концентрация свободных от репрессора неоператорных участков, [Рй(-концентрация комплексов репрессора с такими участками.

Чтобы оценить долю репрессора, связанного с неоператорными участками, заметим, что если [йт,"( — суммарная концентрация репрессора„то [(Ч = [к) + [Рк) + [Ой) = [к!+ [Р((1. Е!одставив выражение для [РК) из уравнения (4), получим [Ч К К вЂ” — — при [Р)» К„. [й ) К + [Р) [Р) Пусть для нашего репрессора Ко = 10' к М (это вполне разумная величина). Концентрация неспецифических участков связывания в бактериальной клетке равна примерно 10 з М. Длина бактериальной ДНК составляет -! 0' пар оснований, и в своих оценках мы полагали, что каждая пара оснований представляет собой начало нового неспецифического участка.

Число неспецифических участков всегда много больше числа молекул репрессора, поэтому мы можем считать, что [Р| = [Р.Д, |де [Рт"! — суммарная концентрация неспецифических участков. Тогда в соответствии с уравнением (5) имеем [!Ц 10 — 4 !0-2 (б) [йт) Отсюда следует, что 99',4 нашего репрессора в клетке не находятся в свободном виде в растворе, а связаны с неспецифическими участками и, следовательно, недоступны для связывания с опера~ором. Это в свою очередь означает, что доля операторов, связанных с репрессором, будет в действительности более чем в 100 раз ниже величины, вычисленной по формуле (3).

И~ах. эффективность связывания репрессора с опера~ором опРеделЯетсЯ двУмЯ величинами: Кп('Ко и [!(т1ЯРг1. В нашем примере при увеличении отношения сродства репрессора к операторной и неоператорной ДНК в 100 раз (т.е. при увеличении в 100 раз величины К (К ) доля свободных от репрессора операторов уменыпится примерно в 100 раз. Чтобы получить результат в обшем виде, подставим в уравнение (2) выражение для [К (, полученное из соотно|пения (5).

После преобразований получим [о) к,, [Р,) [о,) к,[к,) ' Считается, что по крайней мере некоторые специфически связывающиеся с ДНК белки в бактериальной клетке большей частью связаны с ДНК неспецифическим образом, а не находятся в свободном виде в растворе. Этот вопрос трудно решить количественно, поскольку остается ряд неопределенностей: например, 1п к11го сродство репрессора к оператору и к неспецифической ДНК изменяется на несколько порядков при не очень больших изменениях температуры и ионной силы. близких к физиологическим значениям. При этом точные ионные условия внутри клетки нам неизвестны.

Увеличение специфичности Представим теперь гипотетический репрессор с таким отношением сродства к специфическим и неспецифическим участкам ДНК, что при данной концентрации он заполняет оператор всего на 1%. Каким образом можно увеличить эффективность связывания до 99%? Увеличение кониеитраиии белка Как мы уже отмечали, для этого понадобится увеличить концентрацию белка в 100 раз. г1овышение етцифичноети Белок можно модифицировать таким образом, чтобы отношение эффективности специфического и неспецифического связывания увеличилось, Рассмотрим два подхода к решению этой задачи. ° Сродство к специфическим участкам увеличивается, а к неспецифическим остается прежним.

В какой мере возможна такая модификация типичных репрессоров прокариот неизвестно. Скорее всего какого-то результата удастся достичь, введя один-два дополнительных специфических контакта между узнаюшими участками белка и функциональными группами ДНК. ° Отношение эффективности специфическо|о и неспецифического связывания увеличится и в том случае, если увеличить в равной степени число специфических и неспецифических контактов.

Пусть некий репрессор связывается с оператором с К „= 10 'в М, а со случайными последовательностями ДЙК- с К, = 1О 4 М. Теперь удвоим размеры репрессора и оператора, так чтобы они образовывали вдвое больше специфических и неспецифических контактов. Константы связывания более крупного белка с операторными и неспецифическими участками ДНК будут в первом приближении составлять !37 Кое — — !О 'хь М и Кр — — 10 в М. !Удвоение числа контактов означает, что удваивается энергия -Лб; напомним, что К связано с Лб экспоненциально: К = е ьо'вг.

При изменении Лб на 2,8 ккал/моль К меняется в 100 раз.) Обратите внимание, чзо, удвоив размеры репрессора и оператора, мы увеличили отношение эффективностей специфического и неспецифического связывания с 10" до 1О'з. Другими словами, величина К„/Кор возросла в 10ь раз. Итак, наш анализ показывает, что более крупный репрессор работает гораздо эффективнее, чем небольшой по размеру. Однако ~еперь мы сталкиваемся с кинетической проблемой: абсолютное значение константы неспецифического связывания настолько велико, а неспецифических мест так много, что репрессоры практически все время связаны с ними. В результате равновесие между специфическими и неспецифическим связыванием достигается слишком долго.

Суть кинетической проблемы состоит в том, что репрессор, связанный с участком с Ко = 1О в М, остается на этом участке около О,! с. Эта оценка основана на измерении скорости днссоциации комплексов различных репрессоров с операторамн. Мы уже говорили, что в Е. сой имеется примерно 1О' неспецифических участков. Даже если только 10% этих участков будез связано с репрессором, он будет оставаться на них более 25 ч, что примерно в 10 раз больше времени генерации типичной бактериальной клетки. Итак.

мы приходим к выводу, что наш гипотетический репрессор двойного размера не сможет найти свой оператор за время генерации. В состоянии равновесия репрессор действительно будет связан с оператором, но равновесие никогда не будет достигнуто. Существует, по-видимому, и еще одна проблема. связанная с репрессором двойного размера. Величина константы диссоциации К = 1О '~ М означает, что, однажды связавшись с оператором, белок остаезся на нем практически до бесконечности. Никакой механизм индукции или любой дру1 ой клеточный процесс, для которого необходимо, чтобы комплекс репрессора с оператором спонтанно диссоциировал, не сработает в течение сколько-нибудь разумного промежутка времени. Поскольку энергия связывания так велика, для удаления репрессора с оператора необходима радикальная перестройка конформации белка. Использование кооперативности Попытаемся ввести в систему кооперативность.