Пташне - Переключение генов - 1988, страница 25

Встроим еще один оператор рядом с первым, а репрессор сконструируем таким образом, чтобы его молекулы, связанные с этими операторами, взаимодействовали между собой. -тнннн тл а в,н ф 0,6 й т Ю о О,а " 02 о та' та ' 10' тп' 1О' Концентрация репресссрп, и Рис А 1 Чтобы заполнить одиночные операторные участки на 99"'и необходимо в 30 раз больше репрессора, чем для заполнения двойного оператора, с которым репрессор связывается кооперативно Ести продолжить приве- ленные кривые, то мы увидим что для заполнения на 99,9% потребуется уже в 100 раз бо.тьше репрессора При построении кривых предполагалось, что сродство репрсссора к каждому операторному участку при независимом связывании сост автяет — 1О ккал)мотяь и энергия взаимодействия между двумя связанными репрессорами в случае оператора, состояшего из двух участков, достигает — 2 кка смоль Еста же предо мнить себе систему из двух участков связынания, в которой энергия взаимодействия составляет — 5 ккал)' моль то по сравнению с первой системой количество репрессора, необходимое для заполнения 99 и 99,9% участков, будет еше в 40 и 100 раз ниже соответстненно Модель с двумя участками, использованная в данном случае, примерно соответствует заполнению операторных участков Он2 и Опз фага Х (в отсутствие функционального Он1), а модель с одним участком заполнению одиночного участка Опз (Кривая дчя модели с двумя участками построена для случая заполнения одного из них, но.

поскольку участии заполняются практически очновременно, шо мало влияет на форму ириной ) Кривые были построены С Джонсонолт (см работу Ас)тегп ет а1, 1982) Кривые, приведенные на рис А.1, иллюстрируют увеличение эффективности связывания репрессора за счет кооперативного связывания с двумя участками.

При построении кривых предполагалось, что энергия связывания репрессора с единичным участком сосгавляет — 1О ккалг'моль, а при связывании с соседними участками энерт ия взаимодействия молекул репрессора составляет примерно — 2 икал)моль Из рисунка следует, ч го в рамках кооперативной модели для заполнения 99% мест связывания необходимо примерно в 30 раз меньше репрессора, чем при некооперативном связывании. Для заполнения 99,9% мест в случае одного участка необходимо примерно в 100 раз 139 больше репрессора, чем при наличии двух участков. Как уже говорилось в гл. 1, Х-репрессор связывается с матрицей кооперативно.

Если бы Х-оператор состоял только из участка 0„1 или Оя2, концентрация репрессора, характерная для лизогенных клеток, обеспечивала бы заполнение этих двух участков лишь на 90 и на 1О;'о соответственно. Однако взаимодействие между соседними связанными молекулами репрессора„энергия которого достигает по оценкам — 2 ккал/моль, повышает уровень заполнения 0к1 и 0„2 в лизогенных клетках до величины более 99'/, Благодаря кооперативности фактически увеличивается отношение эффекзивностей специфического и неспецифического связывания.

Вероятность связывания двух молекул репрессора на соседних неспецифических участках пренебрежимо мала, поскольку таких участков очень много. В случае фага Х два связанных с ДНК димера репрессора взаимодействуют слабо и ДНК-белковые комплексы легко диссоцинруют. В лругих случаях между связанными с ДНК белками могут возникать более прочные связи, и в них может участвовать несколько разных белков.

Такие взаимодействия обеспечат образование весьма стабильных комплексов даже при условии, что сродство изолированных белковых молекул к ДНК сходно со сродством Х-репрессора к его оператору. Олин из примеров такого рода рассмотрен в приложении 3, ДНК-белковые взаимодействия у эукарвот 5!дро эукариотической клетки гораздо крупнее, чем бактериальная клетка, и содержит намного больше ДНК. Поэтому белку, специфически связывающемуся с ДНК, приходится выбирать свой оператор из гораздо большего числа неспецифических последовательностей, чем в случае бактерий.

Возникают ли при этом какие-либо особые проблемы? Рассмотрим олин пример, для которого можно получить простой ответ. Представим эукариотическое ядро, в котором содержится один Х-оператор. Пусть объем ядра и содержание в пем ДНК в 500 раз превышают объем и количество ДНК в бактерии. Другими словами, суммарная конпентрация ДНК в эукариотическом ядре и в бактериальной клетке одинакова. Отсюла прямо следует, что если конце1прация Х-репрессора в эукариотическом ядре такая же, как в бактерии, т.е. опо содержит в 500 раз больше репрессора, или примерно 10000 молекул, то 1.-репрессор с таким же успехом найдет свой оператор в эукариогическом ядре, как и в случае бактериальной клетки.

(Вообразим неболыпой объем эукариотического ядра, равный объему бактериальной клетки и содержащей оператор. В этих двух случаях способность репрессора связываться с оператором должна быть одинакова.) !40 Эта простая модель в некоторых случаях оказывается весьма близкой к реальной ситуации Действительно, концентрация ДНК в ядрах некоторых эукариот близка к таковой для бактерий Кроме гого, как указано в приложении 3, в тех немногих случаях, когда удалось измерить сродство эукариотических регуляторных белков к операторам, оно казалось близким к соответствующей величине для г.-репрессора н его оператора Приводя эту гипотетическую упрощенную модель, мы намеревались дать читателю о~правную точку в размышлениях цад ответом на вопрос, поставленный в начале раздела В конкретных системах концентрации эукариотических регуляторных белков могут оказаться ниже, чем нам пришлось предположить, а концентрация ДНК вЂ” выше Оба фактора затруднят поиск оператора соответствующим регуляторным белком.

но это затруднение можно преодолеть с помогцью кооперативного связывания Литература: оригинальные статьи 1 Аейеш 6 К Гойптоп А П Ваге М А Г)папа!аггее глоба) Гот депе теки)аттис Ьу Х рйаве гергетаог. Ргос вы!) Ас.и) ва УВЛ, 79, 1129 1133 (1982) 2 эо)ипоп А П Ртттее е А Я Еиигт 6 Ваиег Я Т Агйеш 6 К Р)етйее М Х гсргееаог апг) сто сошропепн о( ап ел)с|оп! шо1сси1аг аттттсЬ, Ы пита, 294, 217 223 (1981) 3 Г.ш 5 Ятддт А Р ТЬе еепега) а(Ттптту оГ )ас гсргсшог Гог Г- го!т Р)ЧА ипрйсаиом Гог кепс геки!еаоп ш рго)гагуо!еа, Сс11, 4, 107 111 (!985) 4 Нелеп И С М 5аисг Я Т $.агпьт)а гергеааог ппйапопа т!ш! 1псгеаее Гйс ашппу апт) трос~лет!у оГ орегагог Ьтиг)тпв, Сс!1, 42 549 558 (!985) 5 !Ьа Нтрре( Р Н Яеешп А 6готт С А Ггйттд А С Ыоп арсстпс Г))ЧА-Ьтпйпв оГ деттошс геяи1аипь рте!с~па аа а Ью!ожса) сопно) шссьашаш ! Гье Гас орстоп сяитЬЬт1ШП аарееш Ргос )Ча!1 Асад вс1 ()8А, 71. 4808 4812 (1974) б Уатеетото К Я Аййего В ТЬе ш!егасиоп оГ еа!гатьо! гессртог рготеш епгЬ Гье 8споше ап агдиптсп! Гот Гас ехтагепсе оГ ипт)е!ссгст) арсс10с пиеа Сеп 4, 301 310 (1975) Приложение 2 Сильные и слабые взаимодействия Взаимодействия компонентов переключателя генов фага Х относягся к двум типам: сильные и слабые.

Энергия ДНК-белковых взаимодействий составляет — 10 — — 15 ккал~моль, что соответствует К„примерно 1О '" М, а энергия белок-белковых взаимодействий примерно на порядок меньше и соответствует равновесным константам диссоциации порядка 10. Репрессор, связанный с Оя!, помогает другому репрессору связаться с Оа2, а тот в свою очередь помогает полимеразе связаться с Р и начать транскрипцию. Но в обоих случаях эффект составляет величину — — 1 — — 2 ккал~моль, что на порядок меньше энергии прямых ДНК-белковых взаимодействий.

Одно из последствий этого различия состоит в том, что при исследованиях ш уйго эффект ~акого рода слабых взаимодействий часто не обнаруживается. Например, если просзо определять интенсивность транскрипции с Р„при высокой концентрации полимеразы, она оказывается максимальной и стимулирующее действие репрессора не выявляется.

Возьмем другой пример. Если удалить Ок! и ОкЗ, репрессор при высокой концентрации будет связываться с Оа2, и сложится впечатление, что 0„1 не имеет отношения к этому связыванию. В обоих случаях вместо увеличения концентрации белка в экспериментах !и И!го можно понизить концентрацию соли и таким образом увеличить константу связывания, Интерпретация подобных экспериментов осложняется тем, что внутри- клеточные условия 1и ч1чо (концентрации взаимодействующих компонентов, ионная сила, рН и т.д.) в точности неизвестны. Если при изучении той или иной регуляторной системы ставится задача выяснить роль всех важнейших компонентов, может оказаться полезным проверигь полученные 1и кйго результаты в экспериментах ш у1ъо, как это было сделано при изучении фага Х. Приложение 3 Единый механизм регуляции транскрипции у эукариот и прокариот Известен ряд генов эукариот, которые отличаются от генов фага Х следуюгцим удивительным свойством: транскрипция каждого из этих генов активируется белком, который связывается на расстоянии нескольких сотен пар оснований от месга инициации транскрипции.