Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.3 (Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - 2001), страница 8

Сопв|п|сь аеиегасес) Ьу РСК вЬои)с) Ье вес)иепсес) |о епвиге Пса| по врипоив п|ша||опв чсеге шггос)исес) с)иппе сЬе ап|РПВса|юп геас|юпв. 2. Е)гаге |Ье Е)Ъ)А ЕгаВ|пеп! сои!а!пшц |Ье сЕ)!с)А/цепе оЕ пйегея| |пго йе ехргеяяоп чес|ог ГСЬаргег 1, Рго|осо! 17 ог 19). 3. Тгапя!огш ап Е, со!|' я|га|п со!|!а!п)пц |Ье Гас)в а11е1е чп|Ь йе гесошЪ|пап! Р1аяпЫ. 1Е |Ье р1аяп|Ы чес|ог пяе1Е сагпея йе 1асГ пепе, |Ьеп апу арргорпа|е я|га|п оЕ Е. соП сап Ъе ияес1.

Р1а|е а1н!иоо оЕ йе сгапя!оппа6оп геас6оп оп ЕВ аВаг сопса!п)па 50 )|В/ш) агпр!с!!1!и. 1псиЬа|е йе си1|игея очегшВЫ а! 37 С. Ав соп|го)в, |гапвгопп |Ье вагпе в|га|п оГ Е. соП' сч)ГЬ а р!аыпЫ висЬ ав РСЕХ-! !Ровшче соп|го!) апс) ап ешр|у ехргевяои р1аяпЫ !перовиче соп|го1). 4. 5сгееп |гапя!оппапгя Ьу со1опу ЬуЪп6!габоп ап6)ог геяпсбоп епгуше апа!уя!я, о1)аопис1ео|Ые ЬуЪп61гаг!оп, ог 6!гес! Т)ХА яеср|епсе апа1уяя )р1еаяе яее СЬар|ег 12, Рго|осо1 3) оЕ р1аяпис1 ппп|ргерагабопя. Орбягп!гаЕ!оп оЕ бте !псяос6!оп оЕ ТагдеЕ РгоЕеяп Ехрге55юп Мапу я|ийея рошс |о |Ье ппрог|апсе оГ |Ье гасе оЕ се!1 Вгосч|Ь оп Гоге!Пп рго|е|п ехргеяя!оп. Рог |Ь|я геаяоп, и Гя ппрог|ап| |о п|оппог йе пигпЬег оЕ Ьас|епа |поси!а|ес1 ш|о |Ье агоисгЬ шейшп, йе 1епВГЬ оЕ 6гпе се!!я аге Вгоисп ЬеЕоге !пс)ис6оп, апс1 |Ье с1епягу |о |чЬкЬ се!1я аге дгосчп аЕгег |пс)ис6оп.

ОчегВго|ч|Ь ог |оо гарЫ Вгосч|Ь сап очег1оас1 йе Ьас|епа! яуп|Ле|к арра|а|ив апд рго|по|е йе Еоппа6оп оЕ шс1ияоп Ъоб!ея. 5. 1поси1а|е 1-|п1 си!сигея ГЬВ ше6!иш сои!а!п)пВ 50 )|В)ш! ашрк11!ш) чч!ГЬ 1 ог 2 со!ошея синга!п)пк |Ье ешр|у ехргеяяюп чес|ог, |Ье роябче соп|го1 р1аяп|Ы (РОЕХ-!), апс1 |Ье гесошЬ~пап| ехргеяяоп р1аяпЫ. 1псиЪа|е йе си1|игея очегп!ВЬ! ас йе арргорпаге |е|прега|иге )20 — 37 С). Веса|ив Е. сох егосчв аЬош Гоиг шпев пюге в!осч!у а| гооп| |еп|рега|иге йап а| 37'С, |Ье сиЬигев |иву по| геасЬ вашгаПоп с)иг)пе о|его!еЬГ Г-)о Ьошя) |псиЬа|юп а| -20'С. Носчечег, йе в1о|чег гасе оГ Ьас|епа! ше|аЬорьп| а| !очсег |еп|регашге шау ргечеи| Гоппаиоп оГ |пс!|ьюп ЪосПев.

Р!саяе вее йе с!ьсияюп оп Г)еа!ша чай !пво1иЫе Рго|е|пв |и |Ье сЬаргег |п|гос!исиоп. 6. 1поси1асе 5 |п) оЕ 1В лопес)!иш сои!а)п!пц 50 )сд)ш! ап|рк|П!и чп|Ь 50 П! оГ еасЬ оъегп)ВЫ си1|иг. 1псиЬа|е йе сипигея Гог )2 Ьоигя а| 20 — 37'С !п а яЬайпВ шсиЪа|ог ип61 се11я геасЬ шЫ-1оВ Цгоъч|Ь ГА|„оЕ 0.5-1.0). 7. ТгапяЕег 1 п|1 оЕеасЬ ип!пбисес1 си!|иге (гего-бэппе а1п!ио!) |о ш!сгоЕиае |иЪея. 1пппе6!аге!у ргосеяя |Ье гего-6гпе а1!с)иогя ая ПеяспЪе6 ш 5геря 9 апс) 10. Ргогосо1 Г: Ехргеззсоп о! СЕопесЕ Сепез и Е, со!с ЬГзспд ЕРТС-ЕпсЕпсйЫе Рготогегз 15.17 1пйисе йе гешашйег оЕ еасЬ сиЬиге Ъу аййспд 1РТб со а Впа1 сопсепсга6оп оЕ 1 гпм апй соп6пие шсиЬасюп ас 20 — 37'С зч!ЕЬ аега6оп ГЬис р!еазе зее сЬе посез Ье!огч сопсегп!пд ор6ш!гас!оп оГ йе 1РТб сопсепсга6оп апй йе !пс1иссюп сешрегашге1.

ТЬе сопсегпгабоп оЕ 1РТ6 шей со шс1исе Гас гергеззог-геди!асей ргопюсегз сап ссгапгагкаПу Гп11иепсе ехргеяюп. ТЬе зиддезсей сопсепсгасюп оЕ 1 пгм 1РТ6 ь а зсаг6пд рошс апй ы ас сЬе ЫдЬег гапде оЕ йе зса1е. ПзсаЫЬЬ ЕЬе орбпшш сопсепсгайоп еспрспсаПу Ьу чагушд йе 1РТ6 сопсепссасюп Ьепчееп 0.01 апс1 5.0 шм.

ччсг!г зогпе ргосешз, П Ь ипрогсапс со гпйисе сгапзспрИоп оЕ сЬе ехргеззюп р1аяпЫ зГозч1у ГгчГЕЬ Гоге ГРТ6 сопсепиасгопз! ю аз пос со очег1оай сЬе ЬюзупсЬейс шасЫпегу оЕ йе Ьассепиш. РесЬарз сЬе пюя ппрогсапг чапаЫе ш оЬсапипд ЫдЬ-Гечес ехргезяоп ш Е. со!1' Ь йе сешрегасше ас зчЬ!сЬ сЬе Ъассепа асс дгозчп ЬеЕоге апй йиппд Гпйисбоп. Гс ы сгис1а! со саггу ош спас зшсдез го йесегпппе сЬе ор6пшгп сегпрегасше Гог ехргезяоп оГ а Гоге!до ргосеш. ТЬе сешрегашге гапде очес гчЫсЬ зиссеззси1 ехргезяоп Ьаз Ьееп оЬсяпей Ь 15-42 С. ТЬе орИпшгп геспрегашге сог ехргеяюп сап Ъе с!и!се паггогч, зраппшд 2 — 4"С.

ТЬе геазоп Гог сЬе зошейпгез аП ог попе с!Гесс оЕ ййегепс сегпрегашгез оп ехргезяоп!ече1з ь пос Гспозчп, Ьш и сои!й Гзе йие со а Гагде пшпЬег оЕ 1ассош, япдГу ог гп сошЬгпа6оп. ТЬезе !ассом Гпс!ийе; йе дгогчсЬ гасе оЕ йе седз, гпсгасеПи!аг Ео1гПпд оГ йе ехргеяей ргосегп, ачадаЬ18су оГ ргозсЬеис дгоирз ГЬепзе, Паз и айепГпе гПпис1еосЫе, Ьюс1п, его.с, сЬеппа! йепасша6оп оЕ сЬе Еогесдп ргосеш, очегсоаеПпд оЕ йе зесгесогу ог Ео1гПпд шасЬгпегу оЕ ЕЬе сеП, йе асбчЬу оЕ епйодепоиз ргосеазез ог осЬег 1уйс епхугпез, асбча6оп оГ ЕЬе 505 гезропзе зузсегп оГ ЕЬе Ьассепшп, ог ойег чапаЫез. Весаые оЕ с1гезе ипсепагпиез, дейапссеп ехрсппгепсз сопсегпшд ор6пшш дгозчсЛ сепгрегасигез аге оЕ 1пс1с изе. Тпа! апй еггог пгизс Ье изей.

Ас чапоиз 6ше ро!псз с1иг!пд сЬе спс1ис6оп репос! !е.д., 1, 2, 4, апс1 6 Ьоигз1, сгапзуег 1 ш! оЕ еасЬ си!сиге со а и!сгоуиде сиЪе, шеазше сЬе Аз о ш а зрессгорЬосогпесег, апй сепспс иде йе сиЬез ас гпахипшп зреес1 Еог 1 пипше ас гоогп сешрегасиге !п а гп!его!оде. Кепсоче ЕЬе Гшрегпасапп Ьу азрсга6оп. Кезизрепй еасЬ ре1!ес ш 100 Гсс оЕ 1х Я>5 де1-1оасПпд ЬиГЕег, апй Ьеас йе зашр1ез со 100 С Гог 3 пиписез. Сешпс оде йе сиЬез ас шахипшп зреес1 Еог 1 пиписе ас гоош сешрегасиге ш а и!сгоуиде, апй зсоге сЬеш оп ке ип61 а11 оЕ йе зашр!ез аге со11ессей апй геайу со !оай оп а де1. 10. 'чггапп сЬе запср1ез со гоош сепсрегасиге апй 1оай 0.15 ОГ3 ипПз ЕоЕ опд!па! си1сиге1 ог 40 Гсд оЕ еасЬ зизрепяоп оп а 10% ЯЭ5-ро!уасгусат!йе де1.

Кип йе де1 аС 8 — 15 гг!сш ип61 йе ЪгопюрЬепо1 Ыие геасЬез йе ЬоССош оЕ СЛе гезо1чшд де1. Яа!п сЬе де! зч!ЕЬ Соошазз!е Вп!11апс В!ие ог я1чег, ог саггу оис ап иппшпоЫос со лзиа1схе сЬе Гпйисей ргосегп Гр1еазе зее Аррепй!х 81. Гп ехсгассз оЕ сеГЬ ехргезяпд йе роясп е сопсго1 ргосеш, 81шасЬюпе д-сгапзЬпазе 165Т! Где,, РСЕХ-1-сопсашшд сеПз1, а 2гг-Гссс ргосеГп зЬои!й Ье ЫяЫе -50 ппписез айег шйиссюп ас 37'С. ТЬе агпоипс оГ С5Т зЬои!й 1псгеазе сЬгоидЬош йе шйис6оп репой. 1п ехсгась оЕ сеПз ехргеяГпд ЕЬе гесогпЪшапс депе, а ргосеГп оЕ с!ге ргейссей шо!еси1аг зче18ЬЕ зЬои!й Ье ляЫе ас юпге сапе ро|пс аГсег шйисИоп. ТЬе Гйпейсз оГГпйиссГоп апй сЬе зсаЬг1пу оЕ сЬе Гоге!до ргосеш шау ййт Ьогп ЕЬозе оГ ЕЬе 65Т сопсго1.

Ьагее-дса!е Ехргеддйоп 01 1Ье Тагее1 Рго1е1п Рог !агде-зса!е ехргезяоп апй рипйсасюп оГ сЬе сагдес ргосе!и, гпоси1асе 50 ш1 оГ 1.В соп- саш!пд 50 Гсд!ш! агпргсП1ш !п а 250-т1 с!аз!с зчссЬ а со1опу оЕ Е. со11 сопсаш!пд сЬе гесогп- Ьспапс сопагисс. 1псиЪасе сЬе си!шге очегп18Ы ас 20 — 37 С. 14. 15. 1поси!аСе 450-500 ш! оГ ЬВ сопСа!шпд 50 Гсдйп1 апсрк!11!п гп а 2-1Кег Паз!с зч!СЬ 5-50 ш! оЕ очегшдЬс си!сиге оГ Е, соЕЬ 1псиЬасе ъчКЬ зЬасс!пд ас 20-37'С ипс!1 сЬе сиЬиге Ьаз геасЬей йе шсй-108 РЬазе оЕ дгоигсЬ !А = 0.5 — 1.01. /5./8 СБартег /5: Ехргетттоп о/'С/опед Сепет тп ЕьсЬепсЬта со1т 16. 1птсисе ехргеатюп о1 сЬе сатдес ргосе[п Ьатед оп сЬе орсипа1 на[пот о! 1РТС сопсепсга6оп, тпсиЪа6оп опте, апд тпсиЬасюп сетпрегасиге десегпппед |п (Ье рген[оит ьессюп.

17. Айег сЬе |пдисед се!Ь Ьаче дготчп 1ог сйе ргорег 1епдсЬ о1 сппе, Ьагнетс сЬе се1Ь Ьу сепспбтда6оп ас 50008 (5500 грпт |п а 5огча1! СВА гогот) 1ог 15 от[пи(от ас 4'С апс! Ргосеет! тчис!т а ри66сасюп ргососоЬ ° Ргососо[ 5 311Ье ехргеттед ргосегп й а 1игдоп тн[сЬ д!исасЬюпе 5-сгапт1егате ° Ргососо! 6 [1(Ье ехргеттед ргосетп ь а Ьттдоп ъч[сЬ пса[соте-Ьтпд[пд ргосе|п ° Ргососо[ 7 т1 (Ье ехргеттед ргосетп сопсатпа а ро[уЬтй6дтпе сад Тс)т/С А)т/33 ОРТ1М1ХАТЗО)ч/ ОЕ РКОТЕ3/т/ ЕХРКЕ553О[т/ ЕКОМ А/т[ МОТЕК гопд Ьассепа| ргопюсег, ап е| Ис|епс пЬотоите-Ь|од!пд т)се й 'кпрогсапс 1ог сЬе ехргетх!оп Е.

соИ. ТЬе пЬотоите-Ыпд)пд все !по!идет ап |п|6адоп сос1оп (АТС) апд а тетсиеисе 5 — 9 пдСЬ |осатед 3 — С т пис[еот)дев ирьСгеаги о1 СЬе |п|С|аСюп сот|оп. ТЫь аетсиепсе, саИед дте ег/иепсе, й соптр|егиептагу Со СЬе 3' Сегпт!пиь о1 Е. со// 165 гКЫА. В)пд(пд о1 |Ье пЬоь (ЬоидЬ( со Ье ргоитосед Ьу Ьате ра!г!пд Ьеинееп сЬе 5Ыпе-Оа|дагпо тет)иепсе |и сЬе ет(иепсе ат дте 3' Сегит!пик о/ СЬе 3 65 гКЕ/А (5Ыпе апд Оа[дагпо 3 974; 5те!Их апд !а[тех 1975; 5те!Их т 979).

ОСЬег тет)пепси !и СЬе ыпптесИате 5'-иптгапь!атед гедюп о1 СЬе ехргеттед депе птау а[то соптпЬите Со ехргеть!оп [ече!ь (Со|д 1988). (5ее а!ьо д)тситт!оп оп р, т 5.32.) ° Р|ас|пд тес)пепси с|оъчпятгеаги 1гоги дте !пьепед О/т(А (Ьас птау тсаЬИые СЬе птКЫЛ ог 'кпргоне (Ье ейс|епсу о1 сгапйадоп И.е., сгапвспрдоп сеггп!пасись ог КЫаье 18 всех) сап аЬо епЬапсе ехргеьяоп (Рапауотатоя аит! Тгиопд т 983; 5(ид!ег апс| Мо//ап 1986; КоьепЬегд ет а|. т 987). ° [/ье о1 ап |РТСИпг|ис|Ые ехргетт!оп честог гегси!геь (таит/огитат!оп о1 ап Е.

соИ ттга(п СЬат онегехргеттеь СЬе /ас гергеятог. ТЬе /ас гергеьтог ргенепст сгаптсг!рдоп о1 1оге!дп депе тег)пепси !п сЬе аЬвепсе о1 !пдисег. 5|псе птоьс |РТС-|пт|ис|Ые ехргеьтюп р1атти(дт аге ргетепс ас ЫдЬ сору пиитЬег (30-600), ехсетт гергевтог й иеет1ес| Со ргечепС Сйгадоп о/ СЬе ргодди апт| тиЬаег/иепт Ьата) |ече3 (|еа1ту) ехргетйоп. ТЬе /ас/ч аИе|е, тчЫсЬ онегргодисеъ СЬе /ас гергеятог Ьу сеп1о|д ъчЬеп ргеьепс |п япд1е сору (Са!от 3 978), )ь птозс соитгпоп|у иъед со онегехргетт дт!х ргосе|п. Нотченег, 6 СЬе 1оге!дп ргосе|п й еврее!а!Ь сох|с со Е.

соИ апт| негу [отч Ьата1 ехргеттюп |ечей саппос Ье со|егасед, ог д а чету ЫВЬ-сору-пигпЬег р!атис)д нессог !т отед (е.д., р(/С-Ьаьед р!ачп!дт), СЬеп а /ас/т депе еЬои|т| Ье с|опет| |иго СЬе ехргеююп р1амп!д Со епьиге С!ВЬС геди1асюп. ТЬЬ ргесаидоп тЬои|с| аЬо Ье сопяс|егет3 тнЬеи Е. соИ ясса!пт (е д., 3МС От апг| 3Мт 05) ЬагЬоппд сЬе /ас/т аИе3е оп ап Р ' тех 1асСог аге иьед.