Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - v.3 (Sambrook, Russell - Molecular cloning. Laboratory manual - 2001), страница 10

1п 'а )ЗЕЗ !уяодепя, |Ье Т7 К14А ро)уп|егаяе депе !я ипс)ег сап|го! о! ГЬе !асО|5 ргоп|осег, гчЫсЬ аПоччя !очч!ечеВ о! |гапяспрдоп !и йе ип!пг)осев ягаге. Еог пюге я|ппдеп| соп|го1 о! ехргеяя!оп, Ьоя|я саггу|пд еЬЬег ргуя5 ог ргуяЕ аге ача!1- аЫе. ТЬе ргуя р1аягп!г)я епсог)е Т7 1уяогугпе, а па|ига) |пЫЬ!|ог о! Т7 й1!А ро)угпегаяе, апс) |Ьия гедисея !гя аЫ!!гу |о |гапяспЬе |агде| депея !п ипгпг)осев се1!я. !Кег)гаучо, уч!|Ь регпняя!оп, !го|и !я)очадеп, )пс.) ° АПопг1ия!оп го )опдег атто-гегтта1 ргоге!и яег)иепсея, ячЫсЬ сап ягаЪ|1!ге яЬог|ег Тоге!дп ро!урерг)с)ея ш Е. соВ !е.д., РЕТ-Зха-с !толп Хочадеп).

° Ргоггисе !паласу апгг яесге2егг иаМе ргоге|пя Ьу !пяегг!пд яес!иепсея сойпд Гог гоге!дп ро1урерг)г)ея а| |Ье Хг)е! я|ге !шшес)!аге1у ргесег!!пд йе АТС оу депе !О ог Ъу 6ля)оп со ап апппо-гегпипа! репр1аяпис 1оса1|ха6оп я!дпа! !рЕТ-12а-с). ° Сгепегауе ргогетя саггутд а )леха-Ьгя6йпе яег!иепсе |Ьаг сап Ъе риг!!)ес) Ьу а)В|п)гу сЬгошагадгарЬу Хг" со1шппя !е.д., рЕТ-14Ъ Егош Мочадеп). 1п а 1ис!г! аг6с!е г!еясг!Ъ|пд йе ЬасгепорЬаде Т7 ргошогег ехргеяя)оп яуягегп, дгис)!ег ег а1. (1990) оп|1!пе ро|еп6а1 ргоЫешя ап|1 яо1и6опя аяяос)агес) чг!|Ь гЬе Ъас|епорЬаде Т7 яуягегп, йясияя ргоя апг) сопя о! чапоия Ъасгепа! ялга!пя, апс) г!еясг!Ъе йе РЕТ яепея оу ехргеяяоп чесгогя. Весаияе |Ье Т7 яуягеш ехргеяяея чеку Ь!ВЬ 1ече!я оу йе !иге!дп депегсЕ|!я)А, йе Ьассепа! яуп|Ьес|с ап|1 ргосеяяшд аррагагия сап еая1у Ьесоше очес!оаг!ег), Рог гЬ!я геаяоп, шейосЬ гЬа| геяи!г !п а я!о|ч !пг)исг!оп ог дгоъч|Ь оГ се!1я оугеп у!еИ Ь!ВЬег 1ече)я о! !иге)дп рго|е|п ехргеяяоп.

ТЬе сгоиЫеяЬоо6пд рапе1 ас йе епг! оГ Ргососо1 1 ргочмХея 6лггЬег аг)ч)се оп |Ьеяе ргоЫешя. сог)оп 11. Е|МА сап Ъе шяеггед ш еасЬ оу йе |Ьгее |гапя1а6оп геаг)!пд Егашея ас гЬ!я сос!оп |о ехргеяя Еия!оп ргосешя. Сопипегс!а!1у ача!!аЫе апг!Ьог))ея (Хочадеп) г!!гесгег) ада!пя| йе депе 1О рогдоп оГ йе 6ля!оп рго|еш сап йеп Ъе ияег) го с)егесг |Ье ехргеяяес) ргосе!п Ьу ипп|ипоЫос- Ипд. О!Ьег !тесрлеп|1у ияес) чессогя: 75.22 СЬаргег 15: Ехрге|ыол о)' С!олед Селе| и ЕьсЬег1сЬ1а со!| МАТЕК1АЕБ САЕ)ТЮ|хс Р1еаье ьее Аррепд1х 72 Гог арргорпа1е Ьапс!!1пе оГ пса!ела!ь таг!сед и|11Ь <! > Се!5 Ро)уасгу)ат|де Ве! Г70;4) солса)п!пВ 5Р5 <! ) рог |Ье ргерагаВоп оГ 505-росуасгу!апсЫе 8е1| пьес! )п сЬе сера|акоп оГ ргосйпь, р1еаье ьее Аррепйх 8. !х!ос!е1с Ас1115 апс! О!фопос!ео1!11е5 Селе ог сРЬ)А ВаВтеп| оГ тгегеп Мес1!а Ь)ЛСУМ аВаг р)асеь селга!птВ 50 СсВ)т! атр!с!Нт Ь)ЛСУМ тесоит соп!асптВ 50 С|В)т! атр!с!77!л Сеп$г!Йдеь апс! Ко1огь 5огчаП С5А гогог ог еди|иа)ел| прес!а! Ецшргпеп1 Во|опВ счагег Ьа!Ь АГ1й6опа! КеацепЬ 5|ер 7 оГ |Ьгь рго|осо! геди|геь !Ье геаВелгь Вяед 5|ер 2 оГ |Ьгь рго|осо! гед|дгеь |Ье геаВепгь 7!ьгед 5|ер 3 оГ ГЬ|ь рго|осо! гедсдгеь ГЬе геаВеп|ь Ьь!ед 5|ер 4 оГ !ЬГь рго|осо! геди|геь |Ье геаВелгь 7|ь|ед )п СЬарсег В, Ргогосо! 7.

!п СЬаргег 7, Рго|осо! 77 ог 79. гп СЬар|ег 7, Рго|осо)ь 23-26. |и СЬар|ег 72, Рго|осо! 3. Чес7огь апс! Васйег!а! Яга1пь Е. со!| ь|гать НМ57 74ГРЕЗ) ог ВЕ27 ГРЕЗ) рЕТ чес(ог ог еди|иа)елг Рог |Ье п|апу чаг|апооь оГ сЬсь р!аипЫ ьепеь, р1еаье геуег со |Ье Ь)оча8еп саса!о8 1ог Ч|еЪ 5!се ас счтчсч.поча8еп.гого). Роы|Гче сопгго! р)аятид Ге.В., саггу!пВ а ЬасгелорЬаВе Т7 рготогег !Ьа| соп!го)ь ехргеьь)оп оГ а Гиь!оп рго1е|л оГ деопед яке) Воггег5 апс! Ьо!о6опь Р!еаье ьее Аррепг!1х 1 Гог сотропеп1ь оГ ь1ос!с ьо1ибопь, ЬиГГегь, апд геаееп1ь.

Р!1и1е ь1ос7| ьо1ипопь 1о СЬе арргорпа1е сопсеп1га11опь. Соотаьяе ВпП)ап| В)ие ь|а|п ог ВВчег яат Р1еаье ьее Аррепйх 8. 7РТС Л М) 7х 5Р5 Ве)-)оасолВ Ьиууег 5соге 1х 8175 8е!-1оайп8 Ьийег 1ае)с)п8 й|ЬЫ|Ь|еао! ас |посо сегорегасше. А|Ы йс!ВосЬгеао! Ггого а 1 ы асое1| )|ис Ъесоге |Ье ЬпКег ы пьес). Ргогосо! 2: Ехргемюп о)~С!опег! Бепег гп Е. со1г Уйп8 йе Васгег!орЬа8е Т7 Ргопюгег 15.23 МЕТНОВ Ргерага1!оп оГ Вас1ег!а Соп1а!и!пе 1Ье ВесогпЬ!пап1 Ехрге88!оп Чес1ог 1.

Мог!1Гу Ьу РСК !СЬарсег 8, Рго!осо! 7), ог )хо!а!е Ьу геяпс!юп епхуше г)18езйоп, а Гга8шепг оГ РХА саггуш8 5'- апг! 3'-гех!г!сгюп епхуше хйех согпра6Ые ъчйЬ хйех ш а ЬасгепорЬа8е Т7 ргошо!ег ехргеах!оп р!аяпЫ (е.ц., РЕТ чесгогх; 5!иг))ег е! а1. 1990). Сопаггись Кепегагее! Ьу РСК аЬоы!8 Ье ае9иепсег! со епюге йаг по арипоиа гпигаиова юеге 1пггойлсег! г1иг1п8 гЬе апгр1!Йсагюп геаспопа. 11 песеяагу, рояиоп а аггоп8 пЬааопге-Ь1пгйп8 яге ираггеаю оГ гЬе АТС оГ гЬе сРХА/8епе. 2. 1л8асе йе РЫА Гга8шепс соп!ашгп8 йе сРХА!депе оГ !и!егехг ш!о !Ье ехргехяоп чес!ог !СЬар!ег 1, Ргогосо! 17 ог 19).

3. ТгапхГопп Е. сей ь!га!и ВЬ2! !РЕЗ) ог НМ5174!РЕЗ) гчйЬ а!нули!а оГ !Ье 118айоп геас!юп. 5е1ес! Гог агпрк11!ш-геяхгап! сгапхГогшапгх Ьу р1а6п8 а119ио!х оГ йе !гапхГогшайоп геасгюп оп Ь!ХС'г'М а8аг р1а!ех сопгашш8 50 !гВГш1 ашркг11ш. 1псиЬа!е гЬе р1агех очегп18Ь1 а! 37'С. Аа а аецаг!че соагго1, ггаяяаггп агЫ1гюаа! ее1!а о! гЬе аагпе агагп ог Е, соб гч1гЬ ап епъргу ехргеаяоп чесгог, 4. 5сгееп йе !гапхГогшапгх Ьу со1опу ЬуЬг!61гайоп апгГ!ог гехгпс6оп епхуше апа1уяя о1!Вопис1ео66е ЬуЬг16!хайоп, ог е!)гес! РХА хес)иепсе апа!уях !Р1еахе хее СЬаргег 12, Ргогосо! 3) оГ р!аяпЫ гшшргерагабопя ОР1ппиа1!оп оГ йе !пг!ос1!оп оГ Тагде1 Рго1е!и Ехргеь8!оп Мапу хги61ех ро)п! го йе ипроггапсе оГГЬе гаге оГ се11 Вгоччй оп Гоге)8п рго!еш ехргехяоп.

Рог 1Ых геахоп, й 1х пирог!ап! со шопйог !Ье пшпЬег оГ Ьас!епа 1поси1а!ес1 1п!о йе Вгогч!Ь ше61- шп, йе!еп8й оГ 6гпе се!1ь аге Вгонгп ЬеГоге шс!ис6оп, апг! !Ье с!епхйу го гчЬкЬ се11х аге 8гогчп айег !пс!исйоп. Очег8гоччгЬ ог соо гарЫ Вгочч!Ь сап очег1оаг! !Ье Ъассепа1 хупгЬейс аррага!их апг) ргогпосе !оппа!юп оГ гпс1ияоп Ъос!!ех. 5. 1поси1аге 1-гп1 си!гигех !Г4УСХМ шее!1иш сопса!п)пц 50 )а8йп! ашркг111п) гчйЬ а !гапхГогшес! со!опу сои!а)п!п8 роя!)че соп!го1 чессогя пецайче соп!го! чесгогя апг) опе сопга)шп8 гЬе гесопгЪ|папс чесгог.

1псиЬасе йе си11игех очегшВЬ! а! 37"С со оЪгагп а ха!ига!- ее) си!гше. 6. !поси1а!е 5 гп! оГ ХХСг'гМ гпе61иш соп!аш!гг8 50 )г8)ш! ашр)с1111п ш а 50-ш! Йах)с гчйЬ 50 р! оГ а ха!ига!ее! си!гиге. 1псиЬа!е йе си11игех Гог 2 Ьоых а! 37"С. 7. Тгапярег 1 гп1 оГ еасЬ си1!иге !лего-6ше а1н)иог) го а ппсгоГи8е гиЬе. 1пппе6!аге1у ргосеах 1Ье хеш-6гпе а1н)иоп ах дехспЬег1 ш 5герх 9 апг! 10.

8. !пс!исе йе геша)пс)ег оГ еасЬ си1!иге Ьу аоЫ)п8 1РТС со а йпа1 сопсепгга6оп оГ 1.0 шм апс1 соп6пие гпсиЪа6оп а! 20-37'С нгйЬ аегабоп. хоппе чесгог ауьгегпа ехргея гЬе ЬасгегюрЬа8е Ту КХА ро!угпегаае !гога а Ьеаг-!пг1ис!Ые ргогпогег гайег йап йот ап !РТС-1пг!ис!Ые ргогпогег. рог а йасшяоп о! Гасгога йаг аГГесг !пдиспоп оГ ргогегп ехргеыюп, р1еаае аее гЬе ноге го пер 8 гп Ргогосо! 1.

9. Ас 0.5, 1, 2, апг1 3 Ьоигх айег Гпг1исгюп, сгапхрег 1 ш1 оГ еасЬ си1!иге со а ш!сгоГице гиЪе, гпеаяпе йе А, гп а хресггорЬо!ошегег, апг) сепгггТи8е !Ье гиЪех а! пгахппшп хреег) Гог 1 пипиге а! гоопг !егпрегашге ш а писгой8е. Кегпоче !Ье аирегпагапгх Ъу ахрйа6оп.

10. Кехихрепс) еасЬ ре11ег !п 100 р1 оГ 1х 5Р5 Ве1-1оа61п8 ЬиГГег, апг! Ьеас йе аашр!ех го 100"С Гог 3 пппшея Сепгг)йг8е гЬе гиЪех а! гпахппшп хреес) Гог 1 пйпиге ас гоопг !епгрегагиге гп а шкгоГи8е, апс! а!иге йегп оп ке ип61 а11 оГ гЬе аашр1ех аге со1!есгег1 апс! геас!у го 1оас! оп а це1. 15.24 СЬаргег 15| Ехргеягоп оЕ С!олег) Сепег )п ЕасЬег!сЬ|а со|| 11. Т4гагш йе аашр1ех то гоош тетпрегатите апс|!оа|1 0 15 ОЕ)сьо ишь (оЕ от)В|па) си1сше) ог 40 рд оЕ еасЬ аиареияоп оп а 109о Я)5-ро!уасгу!ашЫе де1.

12. Кип йе де! ат 8 — 15%сш ип61 )Ье ЪгопюрЬепо! Ыие геасЬеа )Ье Ьоооти оЕ)Ье теао1ч|пд де1. 13. 5)а!п тЬе де1 гч!)Ь Соошаяяе Вп!1|апт В!ие ог я1чег, ог сатгу оит ап иппшпоЪ|ос со чпиа1схе йе )псЬлсес) рготеш |р!еаае аее Арреийх 8). Рог седа ехргеаяпд |Ье чесгог а1опе, по |Исегепсе ш |Ье ргогеш рапегп аЬоп!д Ье логе|) Ьегъчееп ппггапасогшег) Е. соИ сеП| апг) седа саггушд йе егпр|у ехрге|ьюп чесгог.

Рог се1Ь ехрге|ь!пц |Ье гесогпЬ|папг депе, а ргоге|п ос йе рге|!|сге|! пю1еси1аг |че|ИЬ| |ЬопЫ Ъе гаяЫе аг аогпе ип|е ро|пг асгег шдисиоп, Еагке-5са!е Ехргедд|оп оЕ йе Татке| РгоЕе|п 14. Рот 1агде-аса1е ехргетьюп апс| рит!Всатюп оЕ )Ье сагде! Ргосеш, !посо!ате 50 ги1 оЕ ХХС'л'М сопла!п!пд 50 )гдйп1 ап|рк|!1ш !и а 250-ш1 Е)аа)с чптЬ ~пйчЫиа1 со!оп)еа оЕ Е. сод сопсашшд )Ье тесошЬ|папс апг| сои)го! Р1аяпЫя 1псиЬасе )Ье си1сигеа очетп|дЬ! ас 37'С. 15. !поси1асе 450 — 500 ш1 оЕ МХСУМ сопта|п|пд 50 )гд)ш1 ашрк|1|пл !и а 2-!Пег Е)аа)с гч|тЬ 5-50 ш1 оЕ очаги!дЬ! си1|иге оЕ Е.

соВ сопла!шпд йе гесошЬшапс р|аяиЫ. 1псиЬасе )Ье си1сше чп)Ь аЬа)апд ас 37'С ип61 тЬе си!сиге Ьаа геасЬе|1 йе шЫ-1од РЬаае оЕ дгогч)Ь (А, 0.5 — 1.0). 16. 1п Лисе ехртекяоп оЕ тЬе сагдес рготе|п Ъааес) оп )Ье ортииа1 ча1иеа оЕ1РТС сопсепсгабоп, |псиЬатюп тпие, апс) шсиЬагюп сегпрегасиге с)есегпппес| !и тЬе ртечгоиа аестюп. 17. Айег йе !ос|псе|| се!1а Ьаче дгогчи Еог )Ье ргорег 1епд)Ь оЕ типе, Ьагчеас тЬе се1!х Ьу септг|6лдас!оп ат 5000д |5500 грти !и а 5огча11 С5А гогот) Еог 15 пипшеа ат 4'С апс) ргосеес) гч|)Ь а рипйсатюп ргососоЬ ° Ргососо1 5 !Е йе ехрге|ьес) ртосе|п ь а Еияоп чп)Ь д1иса)Ьюпе 5-тгапх|егаае ° Рготосо1 б !| тЬе ехргетьегЛ ртосе|п ь а 6ляоп гч))Ь гпа1соае-Ъ|пйпд ртосеш ° Ргососо1 7 )Е )Ье ехргегьес1 ргосе|п сои)аль а ро1уЬ!ат|йпе гад с)ЫМС рсуа5 АМО рсуаЕ ТО КЕСс)сАТЕ ВАСТЕК!ОРНАСЕ Т7 КМА РОЕУМЕКА5Е АСТ)Ч!ТУ Суаотуте епсог)ег) Ьу ЬастегюрЬаде Т7, |п ас)сдтюп то гддеат!пд рерс)г)од!усап сед |чадя Ьаа йе аЬИ)гу то |пЬ)Ь|! йе чкаИу епсос)ес) КМА ро!ушегтье.

ТЬе Еоггпег аст)ч)су Ь пос пог|паИу гпапдея )п Ьасгепа! се!Ь Ьесасье йе епауше г)оеа пот да)п ассе|а то |Ье сед ч|ад, ТЬе !аиег асдч)у сап Ье иаес) то !пЫЬИ |Ье 1оч !ече! о! КМА ро!угпег|ье ас Ичту ргеаепт )п йе ип)пс)исег) агате апс) |Ьеге!оге то агаЬИые р!аяп)сЬ йаг епсог)е о)Ь- евч)ае тох)с Еоге!дп рготе)пя ТЬе депе епсосИпд ЬасгепорЬаде Т7 !уаотугпе Ь сагпес1 оп пчо сИЕЕегепт р!аяпкЬ тегшес) рсуа5 апс) РСуаЕ, и Ь)сЬ аге сотраПЫе ъч|Ь йе РЕТ частота ап|1 аге согпгпегс)аИу ачадаЫе !Мочадеп; р!еаае аее Е)доге 15-5). Вой р!Иьгп!сЬ епсос)е геа!асапсе то сЫогагпрЬеп)со! апс) аге е|ьИу ша)пга)пес) Ьу дгочаЬ 'а |Ье ргея епсе о1 25 пфп! оЕ |Ье апИЬюИс. Весаиае о1 йе аггапдеп|еп! о1 ргошотега оп йе р!аяп)г)я ехргеьяоп о! !уаотуше Ь !оч )и седа саггу)пд р!ааш)с) рСуа5 апс) Ь)дЬ а се!Ь саггу)пд РСуаЕ (5)и|Пег ет а!.