Диссертация: Детерминанты мембранной активности катионных пептидов и моделирование их терапевтического применения.

Актуальность темы исследования. Мембранно-активные пептиды представляют собой широкий класс малых белков, которые были выявлены во множестве организмов и выполняют большой спектр физиологических задач. Большую часть известных представителей этого класса составляют антимикробные пептиды, которые являются частью врожденного иммунитета и действуют на бактериальные мембраны. Яды многих организмов содержат литические пептиды, повреждающие мембраны клеток. Также мембранно-активные пептиды используются рядом вирусов для проникновения в клетки при заражении. Перечисленные выше пептиды разнообразны по своим аминокислотным последовательностям, но имеют общие физико-химические свойства, такие как короткая длина (< 100 аминокислотных остатков), амфифильная конформация в мембранной среде и, как правило, высокий общий заряд [Guha et.al. 2019]. Ввиду уникальных свойств и биосовместимости мембранно-активных пептидов они являются перспективным классом для решения различных фармацевтических задач [Haney et al., 2019]. Например, антимикробные пептиды рассматриваются как один из эффективных классов новых антибиотиков. Распространение штаммов бактерий, резистентных к существующим антибиотикам, представляет серьезную угрозу для современного здравоохранения, в связи с чем поиск новых антимикробных агентов является важной задачей [Magana, et al., 2020]. Большинство известных антимикробных пептидов действуют посредством разрушения бактериальной мембраны, что уменьшает вероятность развития резистентности, так как изменение мембраны является более сложной задачей для бактерии, чем мутация белковых мишеней стандартных антибиотиков. Возможность некоторых мембранно-активных пептидов проникать внутрь клеток привела к развитию технологий пептидной доставки лекарств. Среди прочего, было показано, что проникающие в клетку пептиды являются перспективными агентами для генной терапии и способны доставлять молекулы ДНК или РНК в клетки-мишени [Guidotti, et al., 2017]. В последнее время было показано, что некоторые литические пептиды эффективны в борьбе с раковыми клетками, и, в частности, могут вызывать активацию иммунной системы организма, направленной на борьбу с опухолью in vivo [Hilchie et al., 2019]. Природные последовательности пептидов не всегда являются оптимальными для терапевтического применения [Magana, et al., 2020]. Рациональный дизайн новых пептидов с подходящими свойствами для решения описанных выше задач, является актуальной и активно развивающейся областью исследований. Для разработки эффективных мембранно-активных пептидов ключевым является понимание физико-химических особенностей, которые определяют характеристики их взаимодействия с липид­ными мембранами [Fjell et al., 2012]. Ранее было показано, что основную роль в процессах связывания пептидов с мембраной играют электростатические взаимодействия и свободная энергия перехода пептидов из раствора на поверхность мембраны, связанная с изменением пространственной структуры [Almeida, 2014]. Особый интерес в настоящее время представляют исследования детерминант аминокислотных последовательностей, определяющих молекулярные механизмы, которые лежат в основе ключевых процессов связывания пептидов с мембранами [Torres et al., 2019]. Кроме оптимизации самих пептидов, важной задачей является поиск эффективного режима их применения в клинике. Одним из путей для преодоления нежелательной токсичности и быстрой деградации терапевтических пептидов в организме является подбор оптимального протокола введения [Deslouches et al., 2017]. Существенные результаты здесь могут дать методы моделирования терапевтического применения, которые были разработаны для прогнозирования эффекта химиотерапевтических препаратов, но ранее не применялись для пептидов [Barbolosi et al., 2019]. Сказанное выше определяет актуальность темы диссертации. Степень разработанности темы. Множество экспериментальных работ, проведенных с момента открытия мембранной активности пептидов, позволило выявить различные биофизические аспекты их взаимодействия с липидными мембранами. При этом оказывается затруднительным выделить единый механизм действия для таких пептидов, напротив, накопленные данные говорят о том, что некоторые пептиды могут задействовать разные механизмы, в зависимости от условий эксперимента, и тем более в изменчивом окружении in vivo [Guha et.al. 2019]. Это осложняет поиск единых детерминант активности, которые можно было бы использовать для разработки терапевтических пептидов. Поэтому на данный момент самыми успешными подходами для разработки новых пептидов являются статистические методы, не опирающиеся на механизме действия пептидов [Torres et al., 2019]. Несмотря на разнообразие механизмов, общим для всех пептидов является высокая аффинность к мембранам [Melo et al., 2009], в связи с чем выявление молекулярных основ, определяющих связывание с липидными бислоями, по-прежнему является актуальной задачей, решение которой позволит повысить эффективность поиска новых терапевтических пептидов. Параллельно с созданием новых пептидов проводятся работы по оптимизации клинического применения уже существующих. Для увеличения биодоступности и снижения токсичности при системном введении на данный момент применяется инкапсуляция в наночастицы или химическая модификация пептидов [Deslouches et al., 2017]. Альтернативным методом может быть оптимизация протоколов введения пептидов при помощи математических моделей. Данный подход успешно применялся в онкологии для увеличения эффективности, снижения токсичности и резистентности опухолей к химиотерапии [Barbolosi et al., 2019], но для терапевтических пептидов ранее не был использован. Цели и задачи. Цель работы заключается в выявлении роли заряженных функциональных групп и характерных мотивов аминокислотных последовательностей в мембранной активности катионных альфа-спиральных пептидов, а также в разработке подходов для оптимизации терапевтического применения мембранно-активных пептидов. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Установить роль электростатических эффектов при связывании модельного катионного пептида с анионными липосомами при различных молярных соотношениях липид/пептид. 2. Определить специфическое влияние ионов растворенных солей калия и натрия на связывание модельного катионного пептида с анионной липидной мембраной при помощи моделирования методом молекулярной динамики. 3. Получить новые терапевтические пептиды на основе характерных мотивов аминокислотных последовательностей природных антимикробных пептидов. 4. Разработать математическую модель для прогнозирования эффекта совместного применения терапевтических катионных пептидов и цитостатических препаратов на рост опухолей in vivo. Научная новизна. Полученные в работе результаты расширяют знания o роли заряженных групп и характерных аминокислотных мотивов катионных пептидов при их взаимодействии с мембранными, а также демонстрируют новые подходы к созданию перспективных терапевтических пептидов и оптимизации их применения. На примере катионного проникающего в клетки пептида EB1, в данной работе впервые подробно изучена роль электростатических взаимодействий при насыщении связывания пептида с анионными липосомами, в условиях низких молярных соотношениях липид/пептид. При помощи атомистического моделирования впервые показано, что значение свободной энергии связывания катионного пептида EB1 с липидной мембраной зависит от вида растворенных ионов из-за различий в связывании ионов калия и натрия с анионными группами липидов. Впервые показано, что альфа-спиральные антимикробные пептиды имеют характерный набор мотивов – паттернов – в аминокислотных последовательностях, который не пересекается с наборами паттернов антимикробных пептидов других структурных классов. Продемонстрирована возможность разработки новых активных пептидов на основе паттернов альфа-спиральных природных антимикробных пептидов. Впервые применен подход фармакокинетчисеких/фармакодинамических моделей для численного описания эффекта катионного пептида на рост опухоли у модель­ных животных, при терапии комбинацией пептида и цитостатического препарата. Теоретическая и практическая значимость работы. Понимание молекулярных основ, определяющих физико-химические взаимодействия пептидов с липидными мембранами, необходимо для рационального дизайна мембранно-активных пептидов для различных фармацевтических применений. Полученные данные о свойствах насыщения связывания пептида EB1 с мембраной при низких молярных соотношениях липид/пептид представляют непосредственный практический интерес, поскольку в физиологических условиях пептиды действуют находясь в избытке на поверхности клеток, в то время, как большинство биофизических данных на сегодняшний день получено в условиях малой доли связанного пептида. Установленная в данной работе специфическая роль растворенных ионов натрия и калия при взаимодействии модельного катионного пептида с мембраной имеет важное значение для прогнозирования влияния ионного окружения на активность пептидов, в частности, в различных условиях солевого состава внутри- и внеклеточной среды. Выявленные характерные паттерны аминокислотных последовательностей, обеспечивающих активность антимикробных пептидов, представляют не только фундаментальный теоретический интерес в качестве детерминант активности в негомологичных последовательностях, а также имеют непосредственное прикладное значение для разработки новых активных пептидов, и расширения пространства поиска перспективных аминокислотных последовательностей. Разработанная математическая модель влияния терапевтического пептида и цитостатического препарата на рост опухолей у модельных животных дает возможность оптимизации доклинических исследований перспективных противоопухолевых пептидов. Методология и методы исследования. Для решения задач работы был использован широкий спектр методов экспериментальной и теоретической биофизики: молекулярное моделирование методом молекулярной динамики, биоинформатические методы и алгоритмы поиска паттернов в аминокислотных последовательностях, численные методы решение систем дифференциальных уравнений фармакокинетики-фармакодинамики и нелинейные методы оптимизации для оценки параметров моделей, экспериментальные методы характеризации молекулярных механизмов взаимодействия пептидов с искусственными липосомами (спектроскопия кругового дихроизма, метод динамического светорассеяния, метод определения дзета-потенциала частиц по электрофоретической подвижности). Положения, выносимые на защиту. 1. При низких молярных соотношениях липид/пептид (< 40), соответствующих условиям экспериментов на клетках, наблюдается насыщение связывания модельного пептида EB1 с анионными липо­ сомами, вызванное электростатическими и стерическими взаимодействиями между адсорбированными на мембране пептидами. 2. Значение свободной энергии связывания катионного пептида EB1 с анионной липидной мембраной выше в растворе, содержащем физиологическую концентрацию ионов натрия в сравнении с аналогичным раствором, содержащим ионы калия. Согласно расчетам молекулярной динамики это вызвано большей аффинностью к поверхности липидного бислоя ионов натрия, чем ионов калия. 3. Альфа-спиральные антимикробные пептиды содержат специфические паттерны, а разработанные на их основе новые пептиды спиральны и проявляют антимикробную активность. При этом значения минимальных ингибирующих концентраций разработанных пептидов определяются значениями свободной энергии их связывания с мембраной. 4. Разработанная математическая модель прогнозирования торможения роста опухоли при воздействии противоопухолевыми препаратами способна описывать синергетический эффект гемцитабина и катионного альфа-спирального пептида мастопаран, наблюдаемый в эксперименте in vivo. Личный вклад автора. Экспериментальное исследование взаимодействия пептида EB1 с мембранами проводилось совместно со Свириной А.А. на базе лаборатории нанобиотехнологий СПбАУ, теоретический анализ и молекулярное моделирование проводились автором лично. Работа по поиску паттернов и разработке новых альфа-спиральных пептидов выполнялась в соавторстве с Елисеевым И.Е., анализ антимикробной активности новых пептидов был произведен д.б.н. Шамовой О.В. Данные in vivo влияния различной терапии на раст опухолей у модельных животных были получены сотрудниками научного отдела СПб онкоцентра (КНПцСВМП(о)), построение математического описания и моделирование роста опухолей проведены автором лично под руководством научного руководителя. Автор лично участвовал в постановке целей и задач работы, выполнении необходимых экспериментов и расчетов, анализе результатов, а также докладывал материалы работы на конференциях, совместно с соавторами готовил тексты публикаций. Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов определяется самосогласованностью представленных в работе данных и выводов, использованием современных экспериментальных методик и установок, методов анализа и статистической обработки полученных результатов, а также согласованностью полученных данных с опубликованными ранее результатами в доступных литературных источниках. Основные результаты работы докладывались на 6 международных и одной всероссийской конференциях: 8th International School and Conference on Optoelectronics, Photonics, Engineering and Nanostructures (25–28 мая 2021 г., Санкт-Петербург, Россия), 62-я Всероссийская научная конференция МФТИ (18–24 ноября 2019, Долгопрудный, Россия), VII Международный симпозиум «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (27–31 марта 2019, Санкт-Петербург, Россия), «BIOMEMBRANES 2018» International Conference (1–2 октября 2018, МФТИ, Долгопрудный, Россия), 4th International School and Conference on Optoelectronics, Photonics, Engineering and Nanostructures (3–6 апреля 2017 г., Санкт-Петербург, Россия) , «BIOMEMBRANES 2016: Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases» International Conference, (26–30 сентября 2016, МФТИ, Долгопрудный, Россия), 1th International School and Conference on Optoelectronics, Photonics, Engineering and Nanostructures (25–27 марта 2014 г., Санкт-Петербург, Россия). Основные результаты работы опубликованы в 11 печатных работах, из них 4 научных статьи в журналах, индексируемых в международных базах данных, и 7 тезисов докладов на конференциях.