Фогель, Мотульски - Генетика человека - 1 (947311), страница 36
Текст из файла (страница 36)
2.3.3.!. Анализ гена человека р-глабинавый ген. Молекула гемоглобина, а также клинические н биохимические последствия ее изменений будут детально описаны в разделе 4.3. Гемоглобин взрослого человека НЬА, состоит нз четырех полипептидных цепей- двух а и двух И раньше было известно, что ген В-цепи тесно сцеплен с некоторыми другими генами гемоглобина, в частности с геном у-цепи, входящей в состав фетального гемоглобина, и геном 6-цепи гемоглобина НЬА,, в небольших количествах обнаруживаемого у взрослого человека. ~3-Глобнновый кластер генов в настоящее время полностью идентифицирован и проанализирован молекулярными методами. Каковы основные этапы этого анализа и какие при эт ом используются методы? Этапы анализа. Анализ глобннового белка.
входящего в состав гемоглобина (разд. 4.3.1 2. Хромосомы человека 123 и 4.3.2), был завершен к началу 60-х г. Цепь )3 состоит из 146 аминокислот. Вся транскрибируемая часть этого гена должна содержать поэтому 438 нуклеотидов (3 х х 146 = 438). Длина такой нуклеотидной цепочки равна 1500 А. Этот маленький кусочек нужно идентифицировать в нити ДНК общей длиной 2 м.
Чтобы оценить трудность такой задачи, представим себе эти величины в другом масштабе; в нити длиной 20 км необходимо отыскать кусочек размером в 1,5 мм. В идеале необходимо расшифровать весь ))-глобиновый кластер генов. Чтобы получить полную характеристику структуры, экспериментальная стратегия должна соответствовать следующим условиям: !) соответствующие фрагменты ДНК должны быть идентифицированы однозначно; 2) они должны быть выделены и накоплены в количестве, достаточном для биохимического анализа; 3) должна быть определена вся нуклеотидная последовательность. Принципы, на которых основаны эти три метода, кратко будут описаны ниже.
Мы начнем с описания второго, поскольку прогресс в выделении и клонировании ~снов был решающим для развития новой генетики. 2.3.3.2. Реетрикционные эндонуклеаэы Первые наблюдения. Заражая фатом ). различные штаммы Е. сой, Арбер [296! обнаружил, что ДНК этого фага при пассаже через бактерию разрезается и теряет свою инфекционность. Оказалось, что ни классические рекомбинационные процессы, ни мутации в этом не участвуют.
Более то|о, такая судьба постигала не только фаговую, но и любую чужеродную ДНК, попадающую в бактерию. Такое разрезание (рестрикцию) следует рассматривать как защитный механизм клетки. Как было показано в дальнейшем, рестрикция чужеродной ДНК осуществляется ферментами, называемыми рестрикционными эндоиуклеазами (рестриктазами). Встаег вопрос, почему рестриктазы не разрезают ДНК собственной клетки. Ответ был найден Арбером и состоял в следующем. Эти ферменты вступа- ют в реакцию с определенными участками в ДНК, так называемыми сайтами узнавания, которые в клетке защищены метильными группами (метилированы).
Правда, первые из открытых эндонуклеаз не были специфическими, а действовали случайным образом. Первой рестриктазой, которая расщепляла ДНК в строго определенном месте, была Нид, открытая Смитом в конце 60-х гг. [496!. Этот фермент впервые использован Натансом и соавт. для создания рестрикционной карты генома вируса ЯО»в [4573. Берг уловил особое свойство двухцепочечной ДНК формировать при обработке рестриктазами так называемые «липкие концы».
После разрезания одна из цепей оказывается длиннее другой на несколько нуклеотнцов. Эти нуклеотиды могут свободно спариваться с другими, например с комплементарными нуклеотидами другого фрагмента ДНК с липкими концами [2993. Благодаря этому ДНК из различных источников может объединяться, образуя рекомбинантные молекулы, Принципы технологии рекомбинаптных ДНК [2397; 60; 493!. Было выделено много рестриктаз (более 150), расщепляющих ДНК в специфических сайтах [117). Например, эндонуклеаза В1 рестрицирует двухцепочечную ДНК по двум сайтам таким образом, что образуются два липких конца: Π— А — А — Т вЂ” Т-С И ~! 8 ~! !! И С вЂ” Т вЂ” Т вЂ” А — А — О ! Липкие концы различных молекул ДНК, расщепленных этим ферментом, могут вступать в комплементарное взаимодействие по четырем А — Т-парам.
Рестрикционные эндонуклеазы различаю~ся по тем сайтам в ДНК, которые они распознают и разрезают. Их можно использовать для различных целей. Однако наиболее распространенным этапом является их применение для амплификации специфической ДНК, что необходимо для определения нуклеотидных последовательностей фрагментов ДНК или для изучения механизмов Клеточнея стснне ромосоме 124 2. Хромосомы человека цлетмнле Клеточная мембрана экспрессии генов. Последняя проблема наиболее важна в практическом аспекте: гены, корд ролируюшие образование функционально активных белков, теперь можно вводить в бактерии и размножать (амплнфицировать).
Эта процедура называется клонированием генов. Благодаря ей появилась возможность нарабатывать в больших количествах белки, которые раньше удавалось получить ничтожно мало. Эта технология основана на следующем принципе: помимо своев собственной кольцевой хромосомы бактерии часто содержат дополнительные , маленькие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, называемые плазмидами.
Плазмиды реплицируюгся автономно н сами могут содержать гены, определяющие устойчивость бактерий к антибиотикам и/или контролирующие синтез веществ, например. колицинов, убивающих прут ил бактерии (рис. 2.83). Плазмидную ДНК можно выделить и рттстттепизь подходящей рестриктазой только в одном сайте, превратив кольцевую молекулу в линейную с липкими концами.
Фрагменгы любой чужеродной ДНК с такими же липкими концами (полученными после разрезания аналогичной рестриктазой) можно сшить с плазмидной ДНК с помощью литазы. Рекомбинантцую конструкцию вводят затем в бактерию, где она реплнцируется (рис. 2.34). Источник экзогенной ДНК не имеет значения. ДНК может быть цолу- Ряс, 2,йэ, Клетка Е.с'од с хромосомой н ллазмидой (212П чела, например, из клщок человека, но можно сшивать и искусственно синтезированные тены. Кроме бактериальных плазмид в качестве векторов (носителей) ДНК используют фаги ).
(объект исследований Арбера). Часть тенома этого фага не обязательна пя его размножения в бактерии. Вместо нето можно ввести чужеродную ДНК, которая будет размножаться вместе с фаговой после инфицирования бактерий. Добиться репликацни и амплификации в составе плазмидной (или фаговой) ДНК после трансформации (или соответственно трансфекции) бактериальной клетки еще не значит решить все проблемы. Прежде всего возникают два вопроса: !, Как распознать клоны, содержащие гиорилную ДНК, среди потомства трансформированных клеток или живых бактериофа|ову 2. Как иденгифицировагь необходимые фра~ менты ДНК среди многих клонированных неизвестных фрагментов'! Например, можно отбирать бактериальные клетки, если они несут плазмнду с фактором устойчивости к антибиотику, выращивая их на среде, содержащей этот ант ибиотнк. Нетрансформированные клетки без плазмид (и, следовательно, без тена устойчивости к антибиотику) просто не будут расти на такой среде.
В последние годы разработано много специальных методов селекции, ксцорые позволяют отби- 2, Хромосомы человека 12б Чужеродная дни Плаэмида ионная еаза Рестрикционная Т Т дд эндонуклеаза ААТТ---.=---=-"-- ТД1 р дл д-д тт фу -- „... Лигаза Ангаза Бактериальная клетка Рис. 2.84. Принцип введения чужеродной ДНК в бактериальную плазмипу с использованием эндонуклеазы й! (2397р 126 2.
Хромосомы человека рать только рекомбинантные клетки, но мы пока не будем их здесь подробно описывать. Для генной инженерии белков недостаточно отобрать и размножить определенные фрагменты ДНК, необходимо еще индуцировать их экспрессию в клетке. Для этого необходимо «подключить» рекомбинантную молекулу к <<машине», которая обеспечивает транскрипцию ДНК, последующую трансляцию матричной РНК и процессинг как на транскрипционном, так и на трансляционных уровнях.
Идентификация и анаяиз генов. Еще одна область применения рестриктаз-идентификация и определение числа генов (3323. Эти задачи решаются с помощью метода, разработанного Саузерном (!975; (492)). Тотальную ДНК из клеток человека гидролизуют эндонуклеазой примерно на 500000 фрагментов длиной от 10г до 10! нуклеотидных пар. Затем фрагменты разделяют по молекулярной массе с помощью гель-электрофореза в агарозе, после чего ДНК денатурируют щелочью прямо в геле, чтобы получить одноцепочечные фрагменты. Их переносят на нитроцеллюлозный фильтр и фиксируют высушиванием при 80'С. В результате получается отпечаток (реплика) картины разделения фрагментов ДНК по их размеру. Эти фрагменты можно идентифицировать методом гибридизации с радиоактивными ДНК-зондами, специфичными для определенных генов или хромосом. Любой фрагмент, содержащий всю последовательность зондируемого гена или его часть, будет выглядеть на радиоавтографе в виде темной полосы (рис.
4.60). Зонды и генные бибяиотеки. Главное условие такого анализа-наличие подходящего геноспецифического радиоактивного ДНК- зонда, который можно использовать для гибридизации (табл. 2.13). В тех случаях, когда имеется в распоряжении матричная РНК, например для В-глобина„специфический зонд можно получить при помощи фермента обратной транскриптазы. Этот фермент катализирует считывание нуклеотидной последовательности мРНК в комплементарную последовательность ДНК, Таблица 2.13.
Д! ! К-зонды, имеющие потенциаль- ное значение для медицины (см. также (328а)) Геиоспеиифические Класзер глобинового <ена (а) Кластер с;юбннового гена (т — бм!!) Гормон роста а-антнтрнпснн Феннлаланнн-гндрокснлаза (ФКУ) Локус НС<РКТ (синдром Лещ-Найхана) Нреальбумнн(амнлондоз) Инсулин Гены нммунослобуяцнов Соматомаммотролин Коллаген СбР(1 Гены Н1.А Фактор свертывания Ч!11 (семофнлня А) Фактор свертывания !Х (гемофнлня В) Фактор свертывания Ч11 Антнтромбнн 3 Рецепторы 1.131. (семейная гноерхолестерн Апопнцоцротенн А1 Аполнпооротенн АН Ацолнпопротенн В Ацолипоцротенн С1 Ацолилопротенн С!1 Аполицооротенн Е НМС< — Со А-редуктаза немня) Неспе««фи»вские Доступны оочзн для всех хромосом, включая хромосомы Х н Ч.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
