Фогель, Мотульски - Генетика человека - 1 (947311), страница 39
Текст из файла (страница 39)
Для более подробной характеристики ~3-глобинового гена необходимо получить большое количество его ДНК, что постигается с помощью клонирования кДНК в каком-нибудь векторе, например в 134 2. Хромосомы человека бактериальной плазмиде (см, разд. 2,3.2.2). Анализ семейства !3-глобиновых генов проводили, сравнивая последовательности геномной ДНК в транскрибируемой области с кДНК методами электронной микроскопии; по данным секвенирования геномной ДНК внутри и вне транскрибируемых последовательностей; с помощью идентификации сигнальных последовательностей.
Первый и наиболее впечатляющий результат состоял в обнаружении с помощью электронной микроскопии того факта, что геномная !3-глобиновая ДНК и кДНК не совпадают по длине и при гибридизации образуют характерные петли ! !3293. Последние формируются за счет тех участков геномной ДНК, которые отсутствуют в кДНК и, следовательно, не транскрибируются, поскольку кДНК является точной копией мРНК.
В гене НЬ(3 были выявлены две такие вставочные последовательности (илглроны), которые разделяют три разные кодируюшие области (экзоны). Исследования, проведенные на многих других эукариотических генах, показали, что наличие интронов является скорее правилом, чем исключением. Этим гены эукариот существенно отличаются от бактериальных и вирусных генов, у которых транскрипция по всей длине одного зека не прерывается. Часто экзоны представляют собой функциональные субъединицы гена. Они могут возникать в ходе эволюции (разд. 7.2.3) как результат объединения нескольких самостоятельных генов. Эти и более поздние исследования подтвердили выводы, сделанные на основании семейных данных об аномальных гемоглобинах (разд.
4.3.2), согласно которым имеется только одни функциональный ген НЬ!3, тогда как, например, гены а и у-глобинов дуплицированы. Однако молекулярные исследования позволили выявить еше и псевдогены, они сходны с последовательностями ДНК функциональных генов, но не транскрибируются вследствие мутаций в кодирующих или фланкирующих участках. На рис. 4.44 показана область НЬ!3. Кроме этого гена и его псевдогена имеются два у-гена, один Б-ген (для Б-полипептидной цепи, входящей в состав НЬАэ) и гены ранних эмбриональных глобинов. Молеку- лярный анализ подтвердил выводы относительно структуры этой генной области, полученные на основании формально-генетического анализа и биохимии гемоглобинов (разд.
4.3), но одновременно дал много совершенно новой информации о структуре и функциональной организации эукариотических генов как таковых. Специальные исследования помогли ответить и на вопрос о том, как происходит транскрипция и как образуется зрелая мРНК (рис. 2.90). Выяснилось, что сначала транскрнбируется весь ген, включая интроны и фланкирующие последовательности, расположенные дистальнее кодирующей области. Затем участки транскрипта, соответствующие интронам, вырезаются, 5'-конец «кэпируется» (блокируется 5-метилцитозином), а 3'-конец защищается ро!у А-последовательностью.
Наконец, мРНК, претерпевшая такой процессинг (созревание), покидает ядро, переходит в рибосомы и используется как матрица для биосинтеза белка. Сейчас известны последовательности ДНК различных глобиновых генов. Изучение этих генов позволило решить много общих проблем, касающихся организации и экспрессии генетического материала в клетке.
Вопросы, связанные с полиморфизмом глобиновых генов на генетическом, клиническом, белковом уровнях и на уровне ДНК, рассматриваются в разд. 4.3. Ряд аспектов мутационного про- Рве. 2.90. Единичная нуклеотвдная цепь ДНК с характерной специфической последовательностью оснований. На 5чкояце, тле начинается транскрипция, обозначены двв характерных участка: СААТ и ТАТА (80 в 30 ц. н.). По ввело! вв с бвктерввльным гевомом предполагают. что последовательность СААТ служат сайтоы узнавания лля РНК-лолимервэы. а участок ТАТА является лроыоторлыы лля ввлуцвруемой лолимервэой транскрипции. ДНК транскрибируется в комплемевтариую последовательность РНК, включая ввтровы.
Затем РНК подвергается процессивгу, интровь| удаляются, 5чколец вкэпируется», а Зсковец закрывается последовательностью ро!у А. После этого созревшая ыРНК проходит через ядерлую мембрану я прикрепляется к рибосоме, где генетическая информация трввслируетск в белковую последовательность. м .е х х ст е.
2. Хромосомы человека 1Зб цесса будет обсуждаться в разд. 5.1.4.3, а эволюционные аспекты — в разд. 7.2.3. ,о в я я я ~1 ы я с я :г жщы:г 2.3.3.7. Структура гена фактора И11 (аитигемофилический фактор) Антигемофихичеекий фактор (фактор )211Д Гемофилия А — «классическая» наследственная болезнь с Х-сцепленным типом наследования (равд. 3.1.4).
Анализ процесса свертывания крови позволил в 50-х гг. идентифицировать белок плазмы -антнгемофилическнй фактор (фактор Ч111). Этот белок отсутствует в крови больных гемофилией А. Фактор Чй! необходим лля первого этапа свертывания крови -образования тромбопластина (см. равд, 4.2.2,9). В настоящее время гемофилию лечат заместительной терапией, вводя концентрат фактора Ч111, что позволяет больным гемофилией вести почти нормальный образ жизни. Белковая молекула этого фактора -большая и сложная, и синтезировать ее поэтому очень трулно. Однако в настоящее время появилась надежла получать этот белок с помощью генной инженерии; расшифрована структура фактора ЧШ, и экспрессию соответствующего гена удалось выявить в культуре ткани (361, 362, 531, 536).
Исследовательская стратегия в изучении гена фактора )гШ. успехи в расшифровке структуры этого гена были достигнуты независимо исследовательскими группами из Сан-Франциско и из Института генетики в Бостоне. Группа из Сан-Франциско действовала следующим образом. Был синтезирован олигонуклеотидиый зонд (длиной в 36 нуклеотидов), соответствующий одному из пептидов, полученных после обработки фактора Ч111 трипсином, Этот очень короткий ДНК-зонд использовали для скринирования Х-фаговой библиотеки геномной ДНК человека с кариотипом 49,ХХХХЧ.
Следовательно, высокая концентрация Х-специфических фрагментов ДНК была получена не при помощи сортировки хромосом, как описано ранее (разд. 2.3.2.5), а благодаря природной аномалии. Клоны, выявленные с помощью гибридизации с ДНК-зондом (равд. 2.3), имели перекрывающиеся концы„благодаря чему оказалось возможной первичная идентификация какой-то части природного гена (рис. 2.91). Ее использовали затем для идентифика- 136 2. Хромосомы человека Библиотека генома человека (49 ХХХХУ) е фаге Л Уникальный опигопукпеогидпый зонд из 36 оснований (подои выбран из пептиде фактора Щ)! после обработки трипсиноы) чМ7 (ч ~ь Зонд идентифицировал сегмент гена другие, частично перекрывающиеся сегменты ...
пока не выявили отрезок ДНК-200 г.п.п., соответствующий гену фактора У((! ДНК фактора У()! была затем секвепировапа и не основе генетического кода выведена амипокиепотпап последовательность фактора У((! (2351 аминокислота) Имсерцип полной последовательности, кодирующей белок (7 г.п.н.) е ппазмиду ы введение е клеточную линию почки хоыпчка -ь экспдесспп фдктоод ч( ! ! ! Сравнение с другиыи генами: гоыопогип между генами церупоппазыима и факторе ц Ппазмида Трапсфекцип ции и обогащения фракции мРНК фактора 3(111 с помощью клеточной линии Т-гибридомы.
Обогащенная фракция мРНК была нужна для получения кДНК всей кодирующей части гена (9 т.п.н.), которую затем секвенировали (разд. 2.3.2.4). Сравнивая кДНК с геномной ДНК, установили границы экзонов. Оказалось, что полный ген состоит нэ 186000 пар нуклеотидов. В нем было обнаружено 26 экэонов длиной от 69 до 3 !06 п.н., один иэ интронов имел длину в 32,4 т. п.н. Белок фактора ч(П1 состоит нз 235! аминокислоты (рис. 2.92). Чтобы добиться экспрессии гена в клетках млекопитающих, его кодирующую часть (-7 т.п.н.) «сшили» с частью перекрывающейся ДНК и встроили в плаэмиду между промоторами и ро1уА-последовательностью вирусного происхождения.
По- лученную рекомбинантную конструкцию с помощью метода кальций-фосфатной преципитации ввели в клетки хомячка. Для выявления экспрессии гена использовали моноклональные антитела к части белка фактора 3(111. В опытных клетках по сравнению с контрольными было обнаружено 300-кратное увеличение количества перекрестно-реагирующего материала. Рне. 2.92. Ген фак.гора УН!. Открытая полиса: гея, внутри полосы закрашены 26 экзонов. 77ижнпй рлд линий: расположение сайтов узнавания )О рестрикционных зндонуклеаз, использованных для идентификации. Серые прямоугольники представляют длину ДНК человека, содержащейся в каждом клоне космнды (р) н Л-фага (По Сг((з(г)ег е! а!., )Ча(цге 3)2, р. 327, )984.) Рце. 2.9!.
Анализ гена фактора У((! человека, начинающийся с получения олигонукпеогидного зонда длиной в 36 оснований. 2, Хромосомы человека 137 Важно отметить, что группа из Института генетики, работавшая в том же направлении, получила аналогичные результаты. о Ф- Значение этих исследований. В работах, суть которых мы изложили здесь весьма кратко и упрощенно, для анализа необычно сложного гена авторы изобретательно использовали многие методы молекулярной биологии.
Их результаты важны по нескольким причинам. 1. Впервые был проанализирован ген такой длины и сложности у человека (да и вообще у эукариот). Весьма вероятно, что многие другие гены, коднрующие длинные и сложные белки, имеют такую же длину и структуру. 2. Результаты структурного анализа позволюот сделать новые выводы относительно эволюции этого гена Г36Ц, учитывая неожиданную гомологию (примерно на 35%) аминокислотной последовательности белка фактора Ч1П с церулоплазмином (белком, связывающим медь) (см. раздел 7,2.3). 3.
Есть основание надеяться, что благодаря генной инженерии лечение гемофилии А станет более безопасным и дешевым. Заместительная терапия препаратами фактора ЧП1 представляет собой один нз примеров успешной корректировки наследственного дефекта: продолжительность жизни больных гемофилией резко увеличилась, и многие из них ведут почти нормальный образ жизни.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
