Фогель, Мотульски - Генетика человека - 1 (947311), страница 38

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 38)

такой последовательностью ДНК, которая структурно гомологична активному гену миозина, но сама не транскрибируется, т.е. не детерминирует синтез миозина, поскольку лишена каких-то важных фланкирующих последовательностей вне транскрибируемой части. Такие псевдогены были обнаружены, например, в пределах кластеров а- и ))-глобиновых генов (разд. 4.3).

Все большее число генов человека успешно локализуегся в хромосомах с помощью этого метода (разд. 3.4, табл. 2.14) 2. Хромосомы человека 131 2.3.3.4. Свквениравинив ДНК [ПУ; 7221 ЗИ] Последовательность нуклеатидов и генетический код. Методы определения последовательности аминокислот в полипептидной цепи были известны еше в 50-х гг, Теоретически это относительно легкая проблема, поскольку все 20 аминокислот, встречающиеся в природных белках, имеют разные свойства. С другой стороны, нуклеотидная последовательность ДНК относительно однородна по составу элементарных звеньев, так как содержит только четыре типа азотистых оснований-гуанин, цитозин, аденин и тимин. Когда еше в 60-х г, был расшифрован генетический код, появилась возможность восстанавливать (дедуцировать) нуклеотидную последовательность транскрибнруемой ДНК по аминокислотной последовательности соответствующего белка.

Однако генетический код является вырожденным, то есть одной н той же аминокислоте соответствуют несколько разных нуклеотидных триплетов. Следовательно, суждения о нуклеотидной последовательности, основанные на последовательности аминокислот в белке,неоднозначны. Кроме того, последовательности аминокислот не содержат никакой информации о последовательности некодируюших участков ДНК. В настоящее время разработаны методы непосредственного секвеннрования ДНК 1117].

Принцип состоит в следующем: длинную молекулу ДНК фрагментируют при помощи агентов, расщепляющих ее в специфических сайтах. Затем определяют последовательность нуклеотидов в каждом из этих фрагментов. Очередность фрагментов в целой молекуле восстанавливают, используя перекрывающиеся концы: идентичные цепи разрезают повторно другой рестриктазой, а затем последовательности перекрывающихся фрагментов, образующихся при обработке двумя рестриктазами разной специфичности, сравнивают. Так может быть реконструирована полная последовательность. В пределах отдельных фрагментов порядок нуклеотидов определяют с помощью специальных методов. Раньше секвенирование ДНК было весьма трудным делом, теперь же оно осуществляется довольно легко и быстро. Для этого необходимо длинную молекулу ДНК с помощью рестриктазы разделить на фрагменты удобного размера, а затем, если нужно, размножить их путем клонирования (разд.

2.3.2.2). В настоящее время секвенируют очень длинные молекулы ДНК. Например, определены уже последовательности всей мнтохондриальной ДНК человека (разд. 2.3.5) и семейства р-глобиновых генов (равд. 4.3). С помощью секвенирования ДНК можно получить более точные сведения н о нетранскрибируемых участках ДНК, важных для контроля транскрипции (так называемые операторы и промоторы). 2.3.3.5. Сортировка хромосом нри помощи Лито4луаро.метрам Зачем нужны сортировка хромосом и нреаараты отдельных хромосом? Сортировка хромосом методам ннтафлуараметрнн используется в двух разных целях; 1) для идентификации н количественного анализа рисунка флуаресценцнн больщага числа хромосом в течение очень короткого времени; 2) для лрепаратнвнага разделения хромосом. Этот метод имеет два преимущества перед стандартными методами анализа хромосом: ан автоматический, благодаря чему нсключаетсн элемент субъективности, и ан намного быстрее. Например, некоторые храмасамные аберрации настолько малы, чта нх невозможно обнаружить обычными метадамн, на прн определенных условиях анн нден~нфнцнруются с помощью пнтафлуараметрнн.

Однако важнее, чта этот метод позволяет нрепаратнвна разделять хромосомы, н прн наличии специфических зондов исследовать структуру н функцию отдельных генов становится относительно просто. В этом случае ген можно локализовать в хромосоме с помощью гибридизации 1н яги, размножить ега ДНК путем клонирования н секвеннравать. Манна нсследавать таким же образом н генетический материал некалнрующнх участков гена. Основой лля такого рода исследований являются генамные библиотеки ДНК. Однако нх неудобства состоит в там, чта обычно трудно нлн невозможно отобрать нэ огромного количества фрагментов интересующие нас последовательности. Кроме нага, изучение распределения ДНК па различным хромосомам нередко само на себе является важным предметом исследования.

Для такага рода работ необходимы библиотека ДНК отдельных хромосом нлн даже нх отдельных фрагментов. ожнтепь жлающнй есценцню ый пуч Отклоняющие пластины Отсортированные хромосомы й Остеющнесп хромосомы 132 2. Хромосомы человека Физический лриииип [364) становится ясен из рис. 2.88. На нем изображена однолучевая система, но используют также и двулучевые системы, в которых применяются два разных пучка света.

Для анализа с помощью двулучевой системы хромосомы окрашивают двумя красителями с максимумом флуоресценции при разных длинах волн. Затем митотические хромосомы отделяют от остального клеточного материала и помещают в систему. Их «прогоняютэ одну за другой через заполненную водой измерительную часть устройства, где они последовательна освещаются двумя лазерными пучками (например, одним ультрафиолетовым, а другим — видимым светом с длиной волны 459 нм).

Два типа флуоресценции, возникающей в точке пересечения потока хромосом и лазерного пучка, собираются линзой и проецируются на отдельные фотоумножители, благодаря чему можно построить двумерное изображение (рис. 2.89) па двум одномерным для каждого красителя и длины волны. В опыте„ представленном на рис. 2.89, были подобраны два таких красителя: один из них окрашивал районы, представленные в основном А Т-ла- Рис. 2.88. Принцип сортировки хромосом с помощью лазера. Хромосомы ократпены флуоресцирующим красителем. Флуоресценция возбуждается лазерным лучом и измеряется для каждой хромосомы отдельно.

Данные измерений используют для сортировки хромосом. (Сонг(езу о( Пг.С, Стешет.) рами, а другой-районы с преимущественным содержанием П вЂ” С-пар. Система может включать приспособление, которое позволяет менять направление потока хромосом в зависимости от рисунка флуоресценции. С помощью такого метода получают относительно чистые препараты отдельных групп морфологически сходных хромосом и даже отдельных хромосом. Сортироека Х- и У-лромосом.

В работе [333, 330) осуществлена препаративная проточная цитофатаметрия Х- и У-хромосом человека. Х-хромосома была выделена из клеточной линии с кариотипом 48,ХХХХ с помощью однолучевой сортировки. Этот материал был использован для приготовления библиотеки хромосомной ДНК после обработки рестриктазой Есой( и клонирования в фаге 2 (см. равд.

2.3.2.2). У-хромосома отобрана с помощью двулучевого сортера из материала гибридной клеточной линии «китайский хомячок х человек». Получение клеточных гибридов будет описано в равд. 3.4В в связи с локализацией генов в хромосомах. Важная особенность гибридных клеток человек х мышь или 2. Хромосомы человека 133 человек х хомячок состоит в том, что лри их размножении утрачиваются преимущественно хромосомы человека. Таким путем была получена клеточная линия, которая имела полный набор хромосом хомячка и только У-хромосому человека.

Поскольку все хромосомы хомячка отличаются от хромосомь1 человека в большей степени, чем сами хромосомы человека между собой, такие клеточные гибриды особенно под- к к к й о о ы В. О Х о о о. й к г и ы чэ 8 ю Возбуждение све~ом с длиной волны 458 нм 1 САЗ.

флуоресиенцня ) Рае. 2.39. Контурный график (интенсивность флуореспенпии) двумерной лазерной сортировки хромосом иэ гибридных клеток «китайский хомячок х человек», в которых осталась только человеческая У-хромосома. Буквы А — К относятся к разным хромосомалг хомячка; буква указывает на У-хромосому человека. А. Все хромосомы; Б. Только маленькие хромосомы. (По (330).) ходят для сортировки. На рис.

2.89 показаны пики на двумерной картине: хромосома, помеченная буквой Б .это У-хромосома человека. Она отделена от остальных настолько четко, что из этого материала можно получить библиотеку ДНК этой хромосомы. 2.3.3.б. Анализ р-глобинового гена и обобщение опыта исследования одного гена. б-глобиновгяй ген. Разд. 2.3.2.1 начинался с анализа структуры )3-глобинового гена, которая была раскрыта благодаря использованию новых методов и подходов. Наиболее важные из них описаны в предыдущем разделе, однако теперь мы снова вернемся к анализу данного гена.

Как уже говорилось, первым этапом является идентификация этого гена в необозримом «море» человеческой ДНК. Для этого ее выделяют из клеток, затем рестрицируют. Образовавшиеся фрагменты разделяют по длине с помощью агарозного гель-электрофореза. грракционированные фрагменты денатурируют и переносят на нитроцеллюлозные фильтры методом блотинга (промакивания) по Саузерну, в результате чего на фильтре ДНК представлена уже в одноцепочечной форме и фиксирована.

Следующий шаг состоит в идентификации фрагмента ДНК, содержащего рглобиновый ген. Для этого необходим радиоактивный ДНК-зонд, который синтезируется на ))-глобиновой мРНК с помощью обратной транскриптазы (мРНК -г кДНК). Этот кДНК-зонд можно использовать теперь для гибридизации с геномной ДНК прямо на фильтре. Радиоавтография позволяет обнаружить фрагменты, содержащие глобиновый ген. Данный метод пригоден и для локализации ))-глобинового гена с помощью гибридизации (п ыш, как описано в равд. 2.3.2.3 на примере гена тяжелой цепи миозина. Ген НЬр был локализован таким способом в коротком плече хромосомы 11 (11р; см. разд. 4.3).

Характеристики

Список файлов книги