Фогель, Мотульски - Генетика человека - 1 (947311), страница 37
Текст из файла (страница 37)
Имеются зонды н лля сегментов хромосом, количество таких зондов возрастаег так называемую кДНК (сама мРНК для гибридизации обычно не используется, поскольку трудно получить ее препараты с достаточно высокой радиоактивной меткой). Для создания библиотеки кДИК может быть использована мРНК из разных источников. Такие библиотеки содержат в основном уникальные нуклеотидные последовательности активно транскрнбируюшихся струкгурных генов или их частей, а также последовательности ДНК из нх блихсайшего окружения. Этн библиотеки используют в основном для обнаружения н характеристики таких генов.
Находят свое применение и геномные бибяиатеки. Их получают путем фрагментирования ДНК рестрикционными эндонуклеазами н последующего кдонирования отдельных рестриктов в векторах. Такие библиотеки удобно использовать, например, для обнаружения 2. Хромосомы человека 127 в геноме комплементарных участков. Нередко в пределах определенной последовательности ДНК обнаруживается реслэрикйиоиный по,ги.чорфиэм. Это значит, что сайты рестрикции могут варьировать у разных индивидов (разц. 23.2.7). В таких случаях зонды можно использовать для классических исследований сцепления в семьях с помощью метоцов, описанных в разд.
3.4.2. Работа с геномной библиотекой весьма грудоемка, учитывая размеры генома человека и количество фрагментов, из которых необходимо отобрать один-единственный, «интересующий» исследователя. Для решения многих вопросов предпочтительнее располагать хро.несомо-слеиифичегкой библиотекой. Ее создание требует выделения отдельных хромосом. В настоящее время это с.гало возможным благодаря сортировке хромосом цитофлуорометрическим методом (разд. 2.3.2.5).
Для синтеза кДНК используется также такое мощное средство, как синтетические олигонуклеотиды, особенно в тех случаях, когда мРНК недоступна (390; 476; 527; 5393. Зная генетический код, можно сконструировать, например„кДНК структурного гена определенного белка, амннокислотная последовательность которо~о известна. В настоящее время существуют автоматические устройства для синтеза любых нуклеотидных последовательностей желаемой длины.
Если ген идентифицирован н особенно если доступен его первичный продукт в фиде мРНК, то анализ тонкой структуры гена можно осуществить на основе комплекса методов, часть из которых описана ниже более детально, Конечной целью таких исследований являются расшифровка полной нуклеотндной последовательности определенного генетического района и установление присущих конкретным группам нуклеотидов специфических функций в транскрипции н ее контроле. 2.3.3З. Гибридизация нуклеиновых кислот Приниил. В разд.
2.3.!.1 мы уже упоминали метод идентификации ДНК-повторов, основанный на разделении двойных цепей прн повышении температуры и их реассо- циации при быстром снижении температуры. Таким образом, в этом методе используется способность комплементарных цепей нуклеиновых кислот гибридизоваться одна с другой и образовывать двойную спираль. То же свойство используется для идентификации разделенных гель-электрофорезом фрагментов ДНК в метоце Саузерна (Бопг)зегп Ыо!!)пя, разд. 2.3.2.2).
Способность к гибридизации цепей ДНК лежит в основе многих методических приемов молекулярной биологии, поэтому более подробное описание принципа гибридизации будет полезным. Большинство природных ДНК встречается в виде цвухцепочечных молекул, Их устойчивость поддерживается благодаря тому, что пиримициновое основание цитозин (С) спаривается с пуриновым основанием гуанином (О), в то время как пиримидиновое основание тимин (Т) спаривается с пуриновым основанием аденином (А). Эти комплементарные пары оснований удерживаются водородными связями (тремя в паре О -С и двумя в паре А Т), которые относительно легко разрываются, но и быстро восстанавливаются, при этом одноцепочечные фрагменты ДНК, присутствуюшие в растворе, снова формируют двойную спираль. Для реассоциации не имеет значения происхождение оцноцспочечной ДНК, не требуется даже полной комплементарности отдельных цепей.
Рсассоциацня происходит даже тогда, когда какая-то часть оснований в каждой цепи не комплементарна (рис. 2.85). Одноцепочечная ДНК может спариваться (гибриднзоваться) даже с РНК, если у ннх есть комплементарные основания. «Прогулка ло хромосоме». Метод гибридизации полезно использовать, например. лля анализа очень протяженного гена. Нрн этом с помощью подходящего зонда аз гсномной библиотеки ДНК извлекается первоначально какая-то часть такого гена. Нуклсотидная последовательность этой части гена будет, как правило, длиннее зонда, н сс концы будут перекрываться с лруэнмн фрагментами данного гена в этой библиотеке, т.е. будут по крайней морс частична гибрилнэоваться с ними. Свободные концы этих фрагментов будут гнбрнцнэоваться со следующими н т.л., пока весь структурный ген нс будет полностью идентифицирован серией перекрываю- А Т А Т 128 2. Хромосомы человека Рис.
2 88. 1!раппа п Д11К илн Р11К ~ норнлизапня, А. Нуклсо~идныс и пи в расгворе, и.! ибрилизация цепей в соо~вмсзвии с правилами спаривания: тимин образует пару с аденннолц пи гозин с шихся фрагментов. Именно таким образом был рекоищруирован глруктурный ген фактора свертывания крови У!!1 человека, необычно длинный. состоягций из 180000 пар нуклеотидов. Рекопсгрукцию начинали с олигонуклеотидного зонда длиной вссг о в 36 нуклеотидов.
Описанный ранее метод, когда сначала выделяется сцецифическая мРНК, а затем с помощью обратной грааслрипгазы на ней синтезируется кДНК, в данном случае оказался непригоден из-за низкой концентрации мРНК. Олигонуклеотидный зонд был синтезирован на основе амннокислотной последовательности фрагмента белка фактора УП1, н ее комплсмснтарность оказалась достаточной для эффективной гибридизации.
Полный анализ гена фактора У1П описан в равд. 2,3.7. Гггорпдпзагуил ьч .гггп. Метод гибридизации гп а11ц особенно удобен для анализа эукарнотических геномов методами молекуляр- атал ча м. Б. 1 нори,,изация можсг происходить джке ~ ра неполной ~олголо~ни, важно, чгобы раз.тачая '» были с. ащком велики. цой ггнто~енетики. Препарат метафазных хромосом обрабатывают радиоактивным ДНЕ-зондом в условиях, позволяющих этому зонду гибридизоваться с хромосомной ДНК. Таким образом исследуемый ген можно локализовать в специфическом хромосомном сегменте.
На первых этапах применение этого метода ограничивалось идентификацией в хромосомах только высоко- повторяющихся нуклеотидных последовательносгей, в частности сателлитной ДНК. Но даже только эти данные позволили сделать важные выводы относительно эволюции человека (разд. 7.2.2). Позже метод гибридизации 1п а!1ц был усовершенствован настолько, что теперь с его помощью можно локализовать в хромосомах даже уникальные гены, такие, например, как ген Рие. 2 йй. Гибридизация !и яги гена тяжелой цепи миозина. Фотография в фазовом контрасте мегафазы после гибридизации с 'Н-меченным кДНК-зоидом и экспонирования в радиоавтографической эмульсии в течение 20 дней. Стрелка указывает иа зерно серебра в теломерном участке короткого плеча хромосомы 17.(По (4823.) !5 !с и 5 о Е Ю О х 1 ! ! 2 3 4 5 6 7 8 9 !в Номер хромосомы Рис.
2.87. Распределение зерен серебра в 36 мета- фазах после гибридизации с кДНК-зондом тяжелой цепи миозина. Гистограмма построена по результатам анализа, основанного на разделении гаплоидного кариотипа человека на 11О равных 1 й Я28 !5 отрезков (хромосомы изображены как одна квазинепрерывная последовательность). Число меченых участков указано для каждого сегмента.
Обнаружен кластер зерен в коротком плече хромосомы !7. (По 1482).) 130 2. Хромосомы человека Таблица 2.14. Некоторые гены человека, иден- тифицированные с помощью гибридизации Лояааизапия Ген, длина последовательности ДИК я число копий )1-глобин (4400 п. н.) а-глобин (800 п, н.) Инсулин (900 п. н.) (.ОН (550 и. н.) Генный кластер плацентарного лактогенного гормона роста Интерферон !ЕХа+ )), 1РХ7 Онкаген с-тус (2750 п.н.) Онкоген с-пюз (2750 п.н.) !8 (6600 п. н.) Гены тяжелых цепей (74) (много) 18 Каппа (10500 п. н.) Гены легких цепей (ч'К) (50) Онкоген ~пуЬ (2000 п.
н.) Онкоген (еа (4000 п, и.) а-фетопротеин (380 п. н.) Сыяороточный альбумнн (1600 п.н,) Онкоген с-щус ( — ) Онкоген с-аЫ (1!00+ 600 п. н) КР(.Р (ПДРФ) (500 н. н.) О1481 18С лямбда (203 п. н.) (семейстао генов) Онкоген Х-газ (4000 п. н.) Мнозин МНС (2200 и.
н.) (7) Колдаген (СО!. 1А2) (7) Онкоген газ (пи1) (2500 п. н.) (1) !1р 16р !!р15 17922-24 9р2,!-р!ег 12924,! 8924 8922 !4932 2р!2 бг(22-24 15924-8!ег 4911-22 4011-22 89 983,4 !4г)31,2 — 3,2 229!! !сеп -р21 ! 7р1,2 — р1ег 7922 Зр25 инсулина ((3773 гл. 3). Для этого используют статистический анализ распределения радиоактивной метки по длине отдельных хромосом во многих метафазных препаратах. В качестве примера рассмотрим теперь основные этапы анализа гена тяжелой цепи миозина ("4823. Вначале был получен кДНК-зонд для гена тяжелой цепи миозина кролика. Поскольку гомологичные гены различных млекопитающих в общем сходны, их гибридизация проходит без затруднений.
Зонд клонировали в плазмипе и выдеденн)ю затем ДНК метили тритием ('Н) с помощью них-трансляции (пюй !гапа!абоп), Для этого ДНК инкубировали с небольшим количеством ДНКазы-1, которая вносит несколько одноцепочечных разрывов в двухцепочечную ДНК. Затем добавляли радиоактивно меченные нуклеотиды и ДНК-полимеразу, при этом меченые нуклеотиды встраивались в ДНК- зонд.
Препараты митотических хромосом получали из культуры лимфоцитов, подвергали специальной обработке с целью денатурации хромосомной ДНК и затем проводили гибридизацию с меченным трнтием ДНК-зондом в течение 16 — 18 ч при 40*С. После отмывания препаратов с целью удаления несвязавшейся нли неспецифически адсорбированной ДНК их экспонировали в течение 3 недель для получения радио- автографов. После окрашивання акрихин- ипритом Я-метод) препараты сфотографировали. На рис. 2.86 показана типичная метафазная пластинка, а на рис. 2.87 — распределение метки по отдельным сегментам всех хромосом человека.
Как видно, основная масса метки обнаруживается на коротком плече хромосомы 17 в сегменте 17р1.2 — р1ег. На основании этого был сделан вывод, что ген тяжелой цепи миозина расположен в хромосоме 17. Поскольку данный эксперимент был проведен с зондом кДНК, мы не вправе утверждать, что идентифицированный миозиновый ген является действительно активным. Он может быть и «псевдогеном», т.е.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
